王帥超，葛玉卿，吳蕾，郭慧，楊仕平，金慶輝

1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234

2 中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050

三種細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作

王帥超1,2，葛玉卿2，吳蕾2，郭慧2，楊仕平1，金慶輝1,2

1 上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234

2 中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050

王帥超, 葛玉卿, 吳蕾, 等. 三種細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 294–300.

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設(shè)計(jì)一種具有“微壩”和“微縫”結(jié)構(gòu)的微流控芯片，能夠物理隔離不同細(xì)胞，而且培養(yǎng)基中小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自由流通。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在芯片上可以共培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞 (A549)、人胚肺成纖維細(xì)胞(HLF-1) 和人內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVECs) 三種細(xì)胞，在72 h培養(yǎng)后三種細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，具有細(xì)胞圖形化的特點(diǎn)和功能，為下一步開展多種細(xì)胞相互作用等相關(guān)研究提供重要的技術(shù)平臺(tái)。

細(xì)胞共培養(yǎng)，微流控芯片，微壩和微縫結(jié)構(gòu)

多種單細(xì)胞共培養(yǎng)可以模擬與生物體內(nèi)相似的微環(huán)境。但傳統(tǒng)方法耗費(fèi)大量的試劑及資源[1]，且不便于實(shí)時(shí)觀察及后續(xù)檢測(cè)。微流控技術(shù)為細(xì)胞體外培養(yǎng)注入新的活力[2-3]。采用微流控技術(shù)采微細(xì)加工工藝制作的細(xì)胞培養(yǎng)載體可以在很大程度上克服傳統(tǒng)方式的不足。通過加工通道特征尺寸在10–100 μm的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片可以極大地限制培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能動(dòng)態(tài)操控和實(shí)時(shí)觀察的不足；而且由于其有效的熱質(zhì)傳輸效率，能夠更加有效地反映體內(nèi)環(huán)境[4]。

通過加工具有特定功能的芯片三維空間結(jié)構(gòu)，可以有效控制細(xì)胞的空間位置。Zhou等[5]研究了肝細(xì)胞及星狀細(xì)胞的共培養(yǎng)及其對(duì)酒精刺激的作用，Harper等[6]探究了癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞的實(shí)時(shí)作用。

據(jù)報(bào)道，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系。它不僅包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，而且亦與腫瘤細(xì)胞自身的內(nèi)在環(huán)境有關(guān)。腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞生存的基礎(chǔ)，而腫瘤血管形成依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。同時(shí)與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞也是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞[8]。本文設(shè)計(jì)和制作具有“微壩”和“微縫”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片，具有細(xì)胞圖形化的特點(diǎn)和功能，有效地解決細(xì)胞共培養(yǎng)中無序混合、摻雜生長(zhǎng)等問題。本研究選擇人肺腺癌細(xì)胞、人胚肺成纖維細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在特定空間生長(zhǎng)繁殖，能夠滿足實(shí)時(shí)觀測(cè)的需求，為進(jìn)一步研究肺癌微環(huán)境提供有效的技術(shù)平臺(tái)。

1 方法

1.1 微通道內(nèi)流體力學(xué)分析

在流體力學(xué)中，流體流態(tài)一般用雷諾數(shù)[9](Re)表示：

其中，u為對(duì)應(yīng)流體的速度，d為流體管道內(nèi)徑，v為對(duì)應(yīng)流體的運(yùn)動(dòng)粘度 (v=μ/ρ，ρ為對(duì)應(yīng)流體的密度，μ為流體的動(dòng)力粘度)；雷諾數(shù)是量綱為1的量，其數(shù)值的大小可反映單相流體的流態(tài)，當(dāng)Re＜2 000，流體呈層流狀態(tài)，在芯片內(nèi)部，微通道是微米級(jí)別，其流體雷諾數(shù)一般小于1，故其內(nèi)部流體仍屬于層流狀態(tài)，如圖1所示，其內(nèi)部主流部分用紅色箭頭示意，即主流與通道結(jié)構(gòu)保持一致，有部分流體流經(jīng)“微壩”下的“微縫”區(qū)域，這也是“C型微壩”可截留目標(biāo)細(xì)胞的流體力學(xué)基礎(chǔ)。

圖1 芯片內(nèi)部微通道流體流向三維示意圖Fig. 1 Three dimensional schematic diagrams of the liquid flow inside the chip channel. (A) and (C) show the channel with and without culture medium respectively. (B) and (D) indicate the micro-dam and micro-gap respectively.

1.2 細(xì)胞共培養(yǎng)微結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及芯片工作原理

本設(shè)計(jì)中，要求微流控芯片能夠有效在特定位點(diǎn)“截留”細(xì)胞。通過在對(duì)應(yīng)區(qū)域設(shè)計(jì)“微壩”結(jié)構(gòu)攔截不同種類細(xì)胞而不互相混雜，從而實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞間的物理隔離。通過不足10 μm的微縫隙攔截到直徑大于10 μm的細(xì)胞個(gè)體。細(xì)胞尺寸量級(jí)在10–100 μm[9]，與光刻膠厚度量級(jí)契合，在尺度上可與微流控芯片良好結(jié)合，可通過控制涂膠厚度實(shí)現(xiàn)不同大小的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究需求。圖2為微流控芯片單元設(shè)計(jì)示意圖，圖A為微通道剖面圖，示意含有細(xì)胞的培養(yǎng)液流經(jīng)聚二甲基硅氧烷[10](PDMS) 與玻璃基底之間的通道，可較好地被微通道內(nèi)部突起的C型攔截壩截留；微縫寬度不到 10 μm，可攔截細(xì)胞；圖B表明細(xì)胞能夠停留在目標(biāo)區(qū)域，即C型攔截壩。由于微縫的作用，培養(yǎng)基中小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自由流通，實(shí)現(xiàn)各個(gè)區(qū)域細(xì)胞的獨(dú)立培養(yǎng)。

圖2 芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of chip structure. (A) Side view. (B) Top view.

2 微流控芯片

2.1 微流控芯片的制作方法

采用piranha清洗[11]方法 (濃硫酸和過氧化氫比例為7∶3) 對(duì)硅片表面進(jìn)行清潔處理。根據(jù)設(shè)計(jì)要求將涂覆有SU8光刻膠的硅片置于甩膠機(jī)上，分預(yù)甩和甩膠兩步，在其表面旋涂致密均勻的既定厚度的膠膜；采用熱板加熱的方式來對(duì)硅片進(jìn)行前烘處理，前烘是為了去除膠體中適量溶劑，增強(qiáng)光刻膠的粘黏性[12]。采用直接接觸式曝光，根據(jù)膠膜厚度不同選擇相應(yīng)的曝光時(shí)間，確保掩膜板的光面與硅基襯底緊密貼合，這一過程可將掩膜板上的圖形轉(zhuǎn)移到硅片上。后烘可促進(jìn)光刻膠內(nèi)部化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，從而使其部分區(qū)域交聯(lián)[13]；將后烘過的硅片放置于盛有丙二醇甲醚醋酸酯溶液 (PGMEA)中進(jìn)行顯影反應(yīng)，可將硅片放入異丙醇溶液中，如果沒有出現(xiàn)白膜則說明反應(yīng)已完全[14]。然后用去離子水洗凈，N2吹干。為了降低硅基模具表面親和性，便于后續(xù)工藝脫模，將硅片放置在含有少量氟硅烷溶液的真空干燥器中，于通風(fēng)櫥中抽真空后，靜置過夜后得到芯片模具。其制備工藝流程如圖3所示。將PDMS與固化劑按10∶1 (重量比) 混合均勻，于真空干燥器抽真空至氣泡完全消失，在水平臺(tái)面上澆注PDMS，置于熱板85 ℃烘焙30 min，自然冷卻至室溫，小心從襯底上剝離，打孔切片后備用。將制備好的PDMS芯片與1 mm載玻片表面進(jìn)行等離子處理[15]，然后鍵合得到微流控芯片。

圖3 微流控芯片制備工藝Fig. 3 Preparation process of the microfluidic chip.

2.2 微流控芯片相關(guān)表征

芯片內(nèi)部通道的連通性，使用紅色染料灌注測(cè)試，如圖4A所示，微通道內(nèi)部高低錯(cuò)落，結(jié)構(gòu)分明，圖4B中可以看出，通道內(nèi)部的深紅色表明主流流經(jīng)區(qū)域，而通道之間的淺紅色部分表明各通道相應(yīng)區(qū)域本質(zhì)“連通”。連通的液體可為物理隔離的各種細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持其生命活動(dòng)。其中細(xì)胞培養(yǎng)單元中細(xì)胞攔截區(qū)域即“C型壩”半徑為90 μm，“壩高”約為42 μm，微通道寬度為80 μm，高約50 μm。

圖4 細(xì)胞芯片圖像 (A：實(shí)物圖；B：?jiǎn)卧鈱W(xué)圖；C和D：SEM圖像)Fig. 4 Images of cell chip. (A) Photograph of the integrated chip. (B) Photograph of cell culture chamber. (C–D) SEM of cell culture chamber.

3 基于微流控平臺(tái)的細(xì)胞共培養(yǎng)

3.1 前處理

對(duì)于微流控芯片，其前處理主要目的是在芯片內(nèi)部營(yíng)造適宜細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的微環(huán)境，步驟主要包括：滅菌及孵育[16]。將芯片在75%乙醇溶液中浸泡1 h，抽真空處理，置于紫外燈下光照滅菌。使用注射泵以一定流速向芯片內(nèi)部通道注入完全培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。

3.2 細(xì)胞導(dǎo)入和培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用人胚肺成纖維細(xì)胞 (HFL1，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)、人肺腺癌細(xì)胞 (A549，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，ATCC)三種細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)培養(yǎng)基采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 (10%胎牛血清、0.1%鏈青雙抗)，培養(yǎng)溫度設(shè)定37.0 ℃，CO2濃度為5%。

將培養(yǎng)皿中已貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化，離心后重懸，得到適宜濃度的細(xì)胞重懸液 (濃度約1×106cells/mL)；采用注射泵正壓注入的方法向經(jīng)前處理的芯片中導(dǎo)入細(xì)胞，由于細(xì)胞懸液長(zhǎng)時(shí)間放置很容易產(chǎn)生細(xì)胞聚沉，造成細(xì)胞進(jìn)樣的不穩(wěn)定及不連續(xù)性。通過多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，將導(dǎo)入過程控制在10 min以內(nèi)較有利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行；同時(shí)通過對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中芯片內(nèi)部各區(qū)域的觀察，也確定了細(xì)胞懸液進(jìn)樣速率與區(qū)域分布的關(guān)系，如表1所示。將進(jìn)樣速率控制在0.3–0.8 mL/h既能夠使細(xì)胞充分填布相應(yīng)攔截區(qū)域，又不至于通道內(nèi)部流速過大將其“沖走”。圖5A中流速0.2 mL/h，為過填充，圖5B流速0.5 mL/h，為理想填充，圖5C流速1.2 mL/h，表明細(xì)胞溢出相應(yīng)區(qū)域。

表1 細(xì)胞懸液進(jìn)樣流速控制Table 1 Effects of cell loading with various velocities

圖5 不同流速控制下細(xì)胞進(jìn)樣圖像Fig. 5 The images of cell loading with controlled flow rates. (A) 0.2 mL/h. (B) 0.5 mL/h. (C) 1.2 mL/h.

4 結(jié)果與分析

基于微流控平臺(tái)的芯片制備，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)制備條件參數(shù)，經(jīng)過清洗、烘干、涂膠、甩膠、前烘、曝光、后烘、顯影和堅(jiān)膜等一系列工藝步驟之后，得到硅基芯片模具。通過在模具上澆注PDMS，熱烘固化后使用等離子清洗機(jī)對(duì)PDMS和玻璃載玻片進(jìn)行表面處理后即為不可逆鍵合，最終得到一批較為良好的微流控細(xì)胞共培養(yǎng)芯片。對(duì)所得微流控芯片進(jìn)行相應(yīng)生物學(xué)處理，主要目的在于滅菌，使其內(nèi)部通道微環(huán)境適于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。在細(xì)胞懸液灌注過程中，可明顯看到微通道內(nèi)部分細(xì)胞依次停留在“微壩”區(qū)域，且排列緊湊 (圖6)，具有細(xì)胞構(gòu)圖的功能。在導(dǎo)入細(xì)胞懸液后，經(jīng)過一定時(shí)間 (不同細(xì)胞貼壁時(shí)間有所差異)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞貼壁后，其形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)出增殖、遷移等行為。將HUVECs、HFL-1及A549共培養(yǎng)于微流控芯片中，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好 (圖7，8)。

圖6 細(xì)胞導(dǎo)入過程圖Fig. 6 The cell loading process. A-I show the images of cell distribution within 1 minute.

圖7 三種細(xì)胞在芯片腔體內(nèi)共培養(yǎng) (24 h)Fig. 7 Co-culture of three cell types in the chamber (24 h).

圖8 在芯片腔體內(nèi)各細(xì)胞形態(tài)圖 (24 h)Fig. 8 The morphology of three cell types in the chamber (24 h).

本文基于微流控制作平臺(tái)，通過軟光刻技術(shù)，制備一批用于細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。Chung等[17]通過在微芯片內(nèi)部放置凝膠物質(zhì)，探究了共培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞向凝膠內(nèi)部遷移行為。Patel等[18]通過設(shè)計(jì)灌注有聚乙二醇的中間通道驗(yàn)證兩側(cè)微腔室內(nèi)相關(guān)癌細(xì)胞旁分泌相互作用。本文中具有“微壩”結(jié)構(gòu)連通區(qū)域的芯片可起到在特定區(qū)域攔截細(xì)胞的作用；通過設(shè)計(jì)“微壩”及“微縫”位置及結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)無內(nèi)置凝膠狀態(tài)下，同一空間特定位置培養(yǎng)特定細(xì)胞層，有效避免細(xì)胞共培養(yǎng)中無序混合，摻雜生長(zhǎng)等問題。在此基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步探究各種類細(xì)胞間相互作用，連續(xù)、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)觀察其相互作用后的形態(tài)學(xué)變化。本研究為共培養(yǎng)過程中細(xì)胞遷移及相互作用、腫瘤微環(huán)境模擬提供一種新的有效實(shí)驗(yàn)思路，而且也可為后續(xù)開展藥物篩選、新藥研發(fā)提供支持。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Design and fabrication of a microfluidic chip for the co-culture of three cell types

Shuaichao Wang1,2, Yuqing Ge2, Lei Wu2, Hui Guo2, Shiping Yang1, and Qinghui Jin1,2
1College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai200234,China
2State Key Laboratories of Transducer Technology,Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai200050,China

Here a microfluidic chip with ‘micro-dam’ and ‘micro-gap’ has been designed and fabricated. It could isolatedifferent cells and flow of medium in each region. It was found that the chip could realize the cells co-culture and patterning of human lung adenocarcinoma cell (A549), human embryonic lung fibroblast (HLF-1) and human endothelial cells (HUVECs), respectively. After 72 hours of culture, three kinds of cells grew well. It provided a developing technical platform for cell related research.

co-culture of cell, microfluidic chip, micro dam and micro gap

s:Yuqing Ge. Tel: +86-21-62511070-8703; E-mail: Yqge@mail.sim.ac.cn.

Received:August 10, 2016;Accepted:November 21, 2016

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB933303), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81472751, 81470875), the Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences (No. YZ201337), the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 15ZR1447000), Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices (No. LBMD201401).

Shiping Yang. Tel: +86-21-64322281; E-mail: shipingy@shnu.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB933303)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81472751，81470875)，中科院裝備研制項(xiàng)目 (No. YZ201337)，上海市自然科學(xué)基金 (No. 15ZR1447000)，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金 (No. LBMD201401) 資助。

時(shí)間：2016-12-01

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161201.1618.002.html