周建平，李志芳，梁笠軒，徐 德

(1.攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院，四川攀枝花 617000；2.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院，四川攀枝花 617000)

肺癌細(xì)胞系中KEAP1與NRF2相互作用區(qū)域基因突變的檢測(cè)*

周建平1,2，李志芳1，梁笠軒1，徐 德2

(1.攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院，四川攀枝花 617000；2.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院，四川攀枝花 617000)

目的 檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中KEAP1及NF-E2相關(guān)因子2(NRF2)相互作用結(jié)構(gòu)域基因的突變情況。方法 以6個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系為材料，檢測(cè)KEAP1基因的第2至第6外顯子及NRF2的DLG和ETGE基序編碼序列的堿基序列突變情況，推測(cè)相應(yīng)的氨基酸序列變異。同時(shí)檢測(cè)供試細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度，分析目標(biāo)序列突變對(duì)肺癌細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響。結(jié)果 在KEAP1基因第4外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個(gè)所有癌細(xì)胞系共有的突變,部分細(xì)胞系的第3外顯子區(qū)域還存在錯(cuò)義突變，所有NRF2-ETGE基序編碼序列均存在多重遺傳變異?；钚匝鯔z測(cè)發(fā)現(xiàn)供試細(xì)胞系活性氧濃度均高于肺胚細(xì)胞。結(jié)論 KEAP1和NRF2基因相互作用結(jié)構(gòu)域的基因突變?cè)诠┰嚰?xì)胞系內(nèi)普遍存在，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度失去調(diào)控能力是普遍現(xiàn)象。

NF-E2相關(guān)因子2；非小細(xì)胞肺癌；KEAP1

NF-E2相關(guān)因子2(NRF2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，調(diào)控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)[1]。NRF2的轉(zhuǎn)錄活性受胞漿蛋白(kelch-like ECH-associated protein-1，KEAP1)的負(fù)調(diào)控[1]。KEAP1通過(guò)其BTB區(qū)結(jié)合Cul3、Kelch區(qū)結(jié)合NRF2，將NRF2連接到E3復(fù)合體，使泛素從E3轉(zhuǎn)移到NRF2的賴(lài)氨酸殘基(位于ETGE基序、DLG基序之間)，泛素化的NRF2被迅速降解[2-3]。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，KEAP1特定的半胱氨酸殘基被氧化修飾，導(dǎo)致DLG基序與KEAP1的親和力減弱而分離，從而使NRF2免于泛素化降解。

研究發(fā)現(xiàn)，KEAP1和NRF2的體細(xì)胞突變常見(jiàn)于肺癌患者體內(nèi)。KEAP1和NRF2的表達(dá)水平影響著非小細(xì)胞肺癌患者的化學(xué)治療效果和無(wú)進(jìn)展生存期[4-5]。約15%的肺癌患者攜帶KEAP1基因的體細(xì)胞突變[6]，從而使得KEAP1失去了對(duì)NRF2活性的負(fù)調(diào)控能力。同時(shí)，約10%的肺癌患者攜帶NRF2基因的體細(xì)胞變異[1]，使其能避免被KEAP1誘導(dǎo)降解，從而始終保持高度的NRF2轉(zhuǎn)錄因子活性。上述體細(xì)胞突變的存在，使得肺癌細(xì)胞能夠持續(xù)大量表達(dá)抗氧化蛋白和解毒酶類(lèi)，是導(dǎo)致癌細(xì)胞耐藥的原因之一[7-8]。本研究以肺癌研究中常用的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系為材料，對(duì)其核基因組中的KEAP1-Kelch區(qū)和NRF2-ETGE基序、NRF2-DLG基序的編碼區(qū)段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測(cè)序，以檢測(cè)在這些常用肺癌研究材料中是否存在上述基因的突變，并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)，分析了上述非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系在肺癌研究中的適用性。

1 材料與方法

1.1 肺癌細(xì)胞的準(zhǔn)備 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC9、HCC827、NCI-H1975、NCI-H1299、NCI-H460、NCI-H661和肺胚細(xì)胞系WI-38均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。凍存的細(xì)胞在37 ℃快速解凍后，1 000 r/min離心 5 min，用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗1～2次，并重懸后再離心，獲得的細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞80%粘連時(shí)收獲細(xì)胞。

表1 PCR擴(kuò)增采用的正反向引物序列

1.2 DNA提取 采用天根快速DNA提取檢測(cè)試劑盒，(KG203)按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行DNA提取。首先取約5 mg細(xì)胞于1.5 mL Eppendorf管，加入100 μL緩沖液B1，用研磨杵(天根目錄號(hào)：WL046)反復(fù)研磨30 s至樣品與緩沖液B1混勻，再加入100 μL緩沖液B2，振蕩混勻，12 000 r/min離心2 min，吸取其上清液直接用于PCR。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序 采用生工PCR擴(kuò)增試劑盒(B532493)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括：模板、正反向引物、PCR Buffer (含Mg2+)、Pfu DNA聚合酶、dNTP。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 2 min進(jìn)行DNA變性；95 ℃ 20 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，循環(huán)40次；最后于72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，于Bio-Rad熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)，目標(biāo)產(chǎn)物條帶切膠回收，獲得30～40 μL的純化產(chǎn)物。PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，得到測(cè)序圖譜及序列。PCR擴(kuò)增采用的正反向引物序列見(jiàn)表1。

1.4 基因突變的檢測(cè) 核酸序列位置編碼參考報(bào)道在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的人類(lèi)基因參考序列:KEAP1 (NM_012289.3)、NRF2(NM_006164.4)。根據(jù)與參考序列比對(duì)結(jié)果,確定檢測(cè)序列是否發(fā)生堿基突變，并用lasergene軟件的MegAlign程序預(yù)測(cè)其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸序列改變。

1.5 活性氧濃度檢測(cè) 采用碧云天活性氧檢測(cè)試劑盒(S0033),按照說(shuō)明書(shū)步驟處理供試的肺癌細(xì)胞。細(xì)胞的準(zhǔn)備如1.1所述，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，按實(shí)驗(yàn)分組接種于48孔培養(yǎng)板，每孔300 μL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞80%粘連時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗每孔細(xì)胞，加入DHE熒光染料，37 ℃下孵育30 min后，分別于熒光顯微鏡和熒光發(fā)光分析儀(Thermo Scientific)下拍照及檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 KEAP1的Kelch結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)外顯子基因突變分析 測(cè)序分析了KEAP1基因第2到第6外顯子區(qū)域的DNA序列,發(fā)現(xiàn)第3和第4外顯子區(qū)域存在錯(cuò)義突變和同義突變(表2)。從錯(cuò)義突變導(dǎo)致的氨基酸改變可以發(fā)現(xiàn)，所有供試細(xì)胞系在KEAP1第4外顯子區(qū)域的4個(gè)相同位點(diǎn)存在相同突變，推測(cè)可能顯著減弱KEAP1與NRF2的親和力。其中3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基電荷性質(zhì)發(fā)生了顯著改變：第446位由酸性谷氨酸(E)變?yōu)閴A性賴(lài)氨酸(K)，第459位堿性精氨酸(R)變?yōu)榻行缘墓劝滨０?Q)，第493位酸性谷氨酸(E)變?yōu)閴A性賴(lài)氨酸(K)，上述氨基酸的變異可導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的顯著改變，從而減弱甚至喪失KEAP1結(jié)合NRF2的能力。第475位纈氨酸(V)變?yōu)楦拾彼釀t可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊能力的顯著改變。同時(shí)，部分細(xì)胞系的第3外顯子區(qū)域也存在錯(cuò)義突變：第333位甘氨酸(G)變?yōu)榘腚装彼?C)，第236位的酸性天冬氨酸(D)變?yōu)閴A性組氨酸(H)。

表2 KEAP1第2-6外顯子基因突變分析

2.2 NRF2-DLG和NRF2-ETGE基因序列編碼基因突變分析 對(duì)DLG及ETGE基因序列的基因突變檢測(cè)結(jié)果顯示，NRF2-DLG基因序列的堿基序列無(wú)突變，NRF2-ETGE基序?qū)?yīng)堿基序列存在多重遺傳變異(表3)。所有供試細(xì)胞系的ETGE基因序列對(duì)應(yīng)堿基序列均存在大量的點(diǎn)突變，同時(shí)在347和352位點(diǎn)還存在缺失突變，推測(cè)其編碼的氨基酸序列發(fā)生了極大改變，幾乎所有位點(diǎn)的氨基酸均發(fā)生了改變，供試6個(gè)細(xì)胞系中不存在可供KEAP1蛋白結(jié)合的ETGE基因序列。

表3 NRF2-ETGE基因序列編碼基因突變分析

續(xù)表3 NRF2-ETGE基因序列編碼基因突變分析

a：NRF2-ETGE基因序列的氨基酸序列為：77DEETGE82。

2.3 肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度檢測(cè) 采用2′,7′-二氧熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)法檢測(cè)供試細(xì)胞系的相對(duì)活性氧濃度發(fā)現(xiàn)，供試肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平均顯著高于肺胚細(xì)胞WI-38，其中NCI-H1975細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度最高，其余細(xì)胞系的活性氧濃度相當(dāng)。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞內(nèi)活性氧相對(duì)濃度比較

3 討 論

KEAP1/NRF2相互作用結(jié)構(gòu)域基因突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞系內(nèi)普遍存在，提示NRF2的轉(zhuǎn)錄因子活性的組成型表達(dá)是肺癌細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵因素。KEAP1-NRF2調(diào)控系統(tǒng)在人類(lèi)細(xì)胞的抗氧化和解毒調(diào)控中發(fā)揮著核心作用，非應(yīng)激條件下，NRF2蛋白通過(guò)與KEAP1-泛素連接酶E3 復(fù)合體結(jié)合，不斷被泛素化降解[9]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，KEAP1蛋白中的活性半胱氨酸殘基被氧化修飾，造成其與E3連接酶親和力下降，使得NRF2能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，從而具有轉(zhuǎn)錄因子活性，能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)一系列抗氧化和解毒基因的表達(dá)[10]。本次檢測(cè)到肺癌細(xì)胞系內(nèi)普遍存在著KEAP1-Kelch結(jié)構(gòu)域和NRF2-DLG/ETGE基因序列基因的突變，且都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)系列的變異，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的異常，KEAP1蛋白不能與NRF2蛋白進(jìn)行正確識(shí)別和結(jié)合。這意味著在供試肺癌細(xì)胞內(nèi)的KEAP1-E3復(fù)合體均對(duì)NRF2失去了抑制作用，NRF2因子可在癌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，使得癌細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白和解毒酶類(lèi)變?yōu)榻M成型表達(dá)，使癌細(xì)胞的抗氧化能力最強(qiáng)化，以適應(yīng)和拮抗癌細(xì)胞內(nèi)高濃度的活性氧累積。

組成型表達(dá)的NRF2轉(zhuǎn)錄活性對(duì)肺癌細(xì)胞的存活是必需的[11]，但是對(duì)于腫瘤治療和腫瘤研究而言，這一變化意味著不好的結(jié)果：NRF2誘導(dǎo)大量解毒酶類(lèi)的表達(dá)，極大地增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐受性，有助于促進(jìn)肺癌細(xì)胞耐藥[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)破壞肺癌細(xì)胞NRF2蛋白的穩(wěn)定性，可以有效提高肺癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性[13,15]。這意味著許多肺癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥可能是NRF2或KEAP1基因突變導(dǎo)致的，使用具有不同遺傳背景的癌細(xì)胞系進(jìn)行藥物測(cè)試可能得出不同的結(jié)論。因此，對(duì)于腫瘤藥物研發(fā)而言，選擇具有恰當(dāng)遺傳背景的細(xì)胞系是藥物細(xì)胞測(cè)試能否成功的關(guān)鍵。

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Mutation detection in the interaction domains of NRF2 and KEAP1 in lung cancer cell lines*

ZhouJianping1,2,LiZhifang1,LiangLixuan1,XuDe2

(1.SchoolofMedicine,PanzhihuaUniversity,Panzhihua,Sichuan617000,China; 2.TheAffiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua,Sichuan617000,China)

Objective To detect the interaction domains′ gene mutations of KEAP1 and NRF2 in non-small-cell lung cancer cell lines,and to analyze the significance of these mutations on the study of lung cancer cell lines.Methods Six non-small-cell lung cancer cell lines were used as the research materials.The 2nd to 6th exons of KEAP1 and the coding sequences of DLG and ETGE motif were amplified by PCR,and the products were used for gene sequencing analysis.Obtained gene sequences were analyzed using NCBI databases to get the base locations of gene mutations,as well as the subsequent amino acid sequence changes.Meanwhile,the relative intracellular reactive oxygen species (ROS)concentrations in the tested cell lines were detected and used in the analysis of abnormal NRF2 transcriptional activity in lung cancer cell.Results Four mutations were detected in the 4th exon of KEAP1 gene from all the 6 cancer cell lines,several other missense mutations were also investigated in the 3rd exon of KEAP1 from some cancer cell lines.Multiple genetic variations were found in all the NRF2-ETGE motif-encoding sequences of the 6 cancer cell lines.All 6 cancer cell lines were found to have higher ROS concentration than the lung germ cell line.Conclusion Lung cancer cells generally contain high levels of ROS as well as gene mutations in KEAP1 and NRF2 genes which lead to abnormal transcriptional activity of NRF2 in lung cancer cell lines.

NF-E2 related factor 2；non-small-cell lung cancer;KEAP1

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301893)；四川省攀枝花市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014TX-10-1)； 攀枝花學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014cxcy084)。 作者簡(jiǎn)介：周建平(1981-)，講師，博士，主要從事腫瘤相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究。

R734.2

A

1671-8348(2017)05-0590-03

2016-06-30

2016-08-28)