趙清梅，余永濤

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，寧夏銀川 750021；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

苦參堿和氧化苦參堿對奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌體外抑制試驗

趙清梅1，2，余永濤3

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，寧夏銀川 750021；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

為了確定苦參堿和氧化苦參堿對奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的體外抑菌活性，選取奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為供試菌株，采用紙片擴(kuò)散法、牛津杯法對2種生物堿進(jìn)行了藥敏試驗，采用液體倍比稀釋法測定了其最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明，苦參堿和氧化苦參堿對奶牛子宮中分離的耐藥性大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)均有一定的抑制作用。苦參堿對耐藥性大腸埃希菌和MRSA的MIC分別為12.5 mg/mL和25 mg/mL，氧化苦參堿對耐藥性大腸埃希菌和MRSA的MIC分別為25 mg/mL和50 mg/mL。

苦參堿；氧化苦參堿；抑菌活性；奶牛子宮內(nèi)膜炎

子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常見病，尤其在高產(chǎn)牛群中發(fā)病率較高，是危害奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一?；疾『?，奶牛情期受胎率降低，配種次數(shù)增加，產(chǎn)犢間隔延長，淘汰率升高，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛子宮內(nèi)膜炎主要由非特異性細(xì)菌感染引起，大腸埃希菌、葡萄球菌和鏈球菌等是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎常見的條件性致病菌。目前治療奶牛子宮內(nèi)膜炎主要采用子宮沖洗和應(yīng)用抗菌藥物。通過抗菌藥物治療雖能控制感染，消除子宮炎癥，但對子宮內(nèi)膜損傷和奶牛繁殖力的修復(fù)作用有限。且大量應(yīng)用抗菌藥物常導(dǎo)致牛奶和胴體藥物殘留超標(biāo)及細(xì)菌耐藥問題。近年來，中藥已廣泛用于子宮內(nèi)膜炎的治療和子宮保健，越來越受到奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重視[1]。

苦參堿和氧化苦參堿為喹諾里西丁類(quinolizidines)生物堿，是苦參(Sophoraflavescens)、苦豆子(S.alopecuroides)、廣豆根(S.subprostrata)等中草藥的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、殺蟲和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多種生理功能[2-4]。有研究表明，苦參堿和氧化苦參堿對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌及馬拉色菌等有一定的抑制作用[5-7]，已用于仔豬細(xì)菌性下痢、羔羊痢疾、奶牛乳房炎等家畜疾病的治療[8]。以苦參堿和氧化苦參堿為主要藥效成分制備的苦參堿栓，已被廣泛應(yīng)用于人宮頸糜爛、慢性宮頸炎、陰道炎等婦科疾病的治療[9]。但苦參堿和氧化苦參堿對奶牛子宮內(nèi)膜炎治療的研究還未見報道。本研究擬開展苦參堿和氧化苦參堿對奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌的體外抑菌試驗，為進(jìn)一步研究開發(fā)用于預(yù)防和治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的中藥制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株CEP003、大腸埃希菌菌株CEE005，均從寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎臨床病料中分離并鑒定[10]。質(zhì)控菌株為敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，均購自中國藥品與生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑 苦參堿和氧化苦參堿，寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號：20110419，純度(HPLC)≥98%；青霉素G、氨芐西林、頭孢西丁、頭孢唑啉、苯唑西林、氧氟沙星、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、卡那霉素、鏈霉素藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌CEP003和CEE005菌株對常用抗菌藥物的敏感性試驗 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測CEP003和CEE005菌株對常用抗菌藥物的敏感性。將金黃色葡萄球菌CEP003和大腸埃希菌CEE005菌株在普通瓊脂上劃線培養(yǎng)。挑取單菌落，接種于MH肉湯，置37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，與麥?zhǔn)媳葷峁軐Ρ?，用無菌生理鹽水將菌液稀釋為1.5×108CFU/mL。取適量稀釋的菌液均勻涂布于MH平板表面，靜置5 min后，分別將青霉素G、氨芐西林、頭孢西丁、頭孢唑啉、氧氟沙星、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素等藥敏片貼于平板表面。37℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。以金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922等標(biāo)準(zhǔn)菌株為質(zhì)控菌，依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)[11]，根據(jù)抑菌圈直徑判定CEP003和CEE005菌株對各種藥物的敏感性，將其分為耐藥(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。

1.2.2 苦參堿和氧化苦參堿對CEP003和CEE005菌株的體外抑菌試驗

1.2.2.1 濾紙片法 采用濾紙片法進(jìn)行體外抗菌活性預(yù)試，用打孔器制備直徑為6 mm的濾紙片，高壓滅菌烘干后，分別置濃度為5、25、50、100、200、400 mg/mL的苦參堿和氧化苦參堿藥液中，浸泡24 h，取出晾干，使濾紙片上的藥物含量分別為2.5、5、10、20、40 mg/片。取適量稀釋的金黃色葡萄球菌CEP003、大腸埃希菌CEE005、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922等菌液均勻涂布于MH平板上，靜置5 min，將上述制備的含有苦參堿和氧化苦參堿的濾紙片貼于平板表面，37℃培養(yǎng)24 h后觀察濾紙片周圍有無抑菌圈出現(xiàn)，有抑菌圈出現(xiàn)記為“+”,無抑菌圈出現(xiàn)記為“-”，并測定抑菌圈直徑。

1.2.2.2 牛津杯法 分別用玻璃涂布器將金黃色葡萄球菌CEP003、大腸埃希菌CEE005、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922菌株菌懸液涂布于MH平板上，靜置5 min。在每個培養(yǎng)皿中放置牛津杯，并輕輕按壓。在每個牛津杯中分別加入200 μL的不同濃度的苦參堿和氧化苦參堿藥液，其濃度分別為2.5、5、10、20、40 mg/mL，置4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)擴(kuò)散2 h，然后將各培養(yǎng)皿放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)抑菌圈，有抑菌圈出現(xiàn)記為“+”，無抑菌圈出現(xiàn)記為“-”，記錄抑菌圈的直徑。

1.2.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用液體倍比稀釋法測定苦參堿和氧化苦參堿對金黃色葡萄球菌CEP003、大腸埃希菌CEE005、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922菌株的MIC[3]。用無菌蒸餾水稀釋苦參堿和氧化苦參堿，使其終濃度為800 mg/mL，取無菌試管10支，分別編號為1～10，每管加入MH肉湯培養(yǎng)基1 mL，取1 mL上述濃度藥液加入1號試管并混勻，從1號試管吸取1 mL液體加入2號試管并混勻，再從2號試管吸取1 mL液體加入3號試管，依次類推倍比稀釋至第8號試管，各管藥物濃度依次為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。各管中依次加入100 μL待測菌液，9號管加菌液不加藥液為陰性對照，10號管既不加菌液也不加藥液為空白對照，每種藥物重復(fù)3次。將接種好的試管置恒溫?fù)u床37℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，無細(xì)菌生長的最低藥物濃度，即為該藥物對受試菌的MIC。

2 結(jié)果

2.1 常用抗菌藥物藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果見表1。金黃色葡萄球菌CEP003對各種藥物均耐藥，為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。大腸埃希菌CEE005除對頭孢類藥物中度敏感外，對青霉素G、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星、卡那霉素均耐藥。

表1 金黃色葡萄球菌CEP003和大腸埃希菌CEE005對常見抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果

注：“R”表示耐藥,“I”表示中度敏感。

Note：“R” means resistance,“I” means medium sensitivity.

2.2 體外抑菌活性試驗

苦參堿和氧化苦參堿體外抗菌活性預(yù)試結(jié)果見表2。在紙片擴(kuò)散法和牛津杯法中，2種生物堿對大腸埃希菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑均顯著大于金黃色葡萄球菌，苦參堿對2種細(xì)菌的抑制作用均顯著強(qiáng)于氧化苦參堿。

2.3 最小抑菌濃度測定結(jié)果

苦參堿和氧化苦參堿對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果見表3。

3 討論

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛常發(fā)病之一，細(xì)菌感染是其主要原因。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌種類很多，不同的地域、不同的牛場，甚至同一牛場的不同的個體因飼養(yǎng)環(huán)境、產(chǎn)后護(hù)理等因素其病原菌不同，盡管已報道的各地病原菌種類不一致，但多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)其主要致病菌為葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌[1]，從寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎患牛分離出的主要致病菌為大腸埃希菌和葡萄球菌[10]，因此本研究以其為供試菌株。目前，寧夏地區(qū)治療奶牛子宮內(nèi)膜炎主要采用靜脈注射青霉素、氨芐西林等抗菌藥物。藥敏試驗結(jié)果表明，CEP003對各種藥物均耐藥，CEE005菌株除對頭孢類藥物中度敏感外，對青霉素G、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星及卡那霉素均產(chǎn)生耐藥?？咕幬锏拇罅渴褂檬沟媚退幘瓴粩喈a(chǎn)生，生產(chǎn)中為了提高療效，往往會加大藥物的使用劑量，不僅增加了生產(chǎn)成本，還會導(dǎo)致生鮮乳藥物殘留超標(biāo)，帶來嚴(yán)重的食品安全問題。

表2 不同濃度的苦參堿和氧化苦參堿體外抑制作用

注：“-”表示無抑菌效果。

Note:“-”indicated that inhibition zone is not observed.

表3 苦參堿和氧化苦參堿最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果

體外抑菌試驗結(jié)果表明，苦參堿和氧化苦參堿對分離自奶牛子宮的2種耐藥性致病菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株均有不同程度的抑制作用，大腸埃希菌對苦參堿和氧化苦參堿的敏感性要顯著高于金黃色葡萄球菌，2種菌對苦參堿的敏感性也高于氧化苦參堿。有報道認(rèn)為，苦參堿被氧化為氧化苦參堿后，分子中氮原子價態(tài)發(fā)生了變化，苦參堿中的一個胺變成了氧化胺，導(dǎo)致了抑菌活性降低[12]。牛津杯法體外抑菌試驗表明，當(dāng)苦參堿濃度為2.5 mg/mL時，即會對大腸埃希菌菌株CEE005、ATCC25922產(chǎn)生輕微的抑制作用。最小抑菌濃度測定結(jié)果也表明，苦參堿和氧化苦參堿對大腸埃希菌的最小抑菌濃度分別為12.5 mg/mL和25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌菌株的最小抑菌濃度為25 mg/mL～50 mg/mL和50 mg/mL。據(jù)張愛君等[12-13]報道，苦參堿對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為12.5 mg/mL和25 mg/mL。陳靜等[5-6]研究了苦參堿和氧化苦參堿對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的體外抗菌活性，結(jié)果表明苦參堿、氧化苦參堿對MRSA的最小抑菌濃度為31.6 mg/mL和50 mg/mL，對甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA) 的最小抑菌濃度為22.5 mg/mL和32.5 mg/mL。本試驗中，苦參堿和氧化苦參堿對MRSA和MSSA也均有一定的抑制作用，與陳靜等的結(jié)果較為接近。

苦參堿具有抗菌、抗炎、抗瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)等方面作用，被廣泛用于臨床。本試驗選擇中草藥提取物苦參堿、氧化苦參堿對臨床分離的導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌進(jìn)行體外抗菌作用研究，結(jié)果顯示苦參堿、苦參堿對從臨床分離的耐藥性菌株和敏感菌株均有一定的抑菌活性。但其最小抑菌濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床上已廣泛應(yīng)用的抗菌藥物，下一步需要對2種藥物的體內(nèi)使用劑量和對以上病原感染的治療效果進(jìn)行研究。

參開文獻(xiàn):

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Antibacterial Activity of Matrine and Oxymatrine on Pathogenic Bacteria Causing Cow EndometritisinVitro

ZHAO Qing-mei1,2,YU Yong-tao3

(1.CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeifangUniversityofNationalities,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 2.KeyLaboratoryofFermentation,BrewingEngineeringandBiotechnology,StateNationalitiesAffairsCommission,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 3.CollegeofAgronomy,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

To investigate the antibacterial effects of matrine and oxymatrine on the pathogenic bacteria isolated from uterus of cows with endometritis,the experiment was conductedinvitro.The antibacterial effects on drug-resistanctE.coliand methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) were screened by Kirby-Bauer paper dispersion and Oxford cup method respectively.The minimal inhibitory concentration (MIC) of matrine and oxymatrine against drug-resistanctE.coliand MRSA were determined respectively by the method of tube double dilution method.The results showed the drug-resistanctE.coliand MRSA were inhibited by matrine and oxymatrine in different degree.MIC of the matrine against the drug-resistanctE.coliand MRSA were 12.5 mg/mL and 25 mg/mL.MIC of the oxymatrine against the drug-resistanctE.coliand MRSA were 25 mg/mL and 50 mg/mL.

matrine；oxymatrine；antibacterial activity；cow endometritis

2016-09-18

寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ12202)

趙清梅(1979-)，女，四川南江人，副教授，博士，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。

S853.76

A

1007-5038(2017)01-0065-04