劉 升，孟露萍，張 輝，付 強，史慧君，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；2.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

bta-miR-205和bta-miR-497調控牛病毒性腹瀉病毒復制的研究

劉 升1，孟露萍1，張 輝1，付 強2，史慧君2，陳創(chuàng)夫1*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000；2.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

為探究bta-miR-205和bta-miR-497對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)復制的調控作用，在前期建立BVDV感染MDBK細胞miRNAs差異表達譜的基礎上，篩選出表達量顯著差異的bta-miR-205和bta-miR-497，通過生物信息學軟件預測、熒光素酶報告基因檢測等方法鑒定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因。應用RT-qPCR和病毒滴度測定等方法驗證bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV復制的影響。結果發(fā)現(xiàn)，bta-miR-205能顯著抑制BVDV的復制，而bta-miR-497顯著促進BVDV的復制。研究結果為BVD防控提供了新的思路和依據(jù)。

牛病毒性腹瀉病毒；復制；bta-miR-205；bta-miR-497

隨著集約化養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以發(fā)熱、腹瀉、黏膜糜爛潰瘍、懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒為主要特征的牛病毒性腹瀉-黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)已成為嚴重影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展、造成全球養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失的主要病原[1-2]。BVDV還是牛源生物制品(如血清、凍精、胚胎、疫苗等)常在的污染源，嚴重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和科學研究工作[3]。但是由于BVDV與宿主細胞相互作用的分子機制、BVDV持續(xù)性感染和免疫抑制的分子機制尚未系統(tǒng)闡明，目前尚無有效的防控技術和手段。歐美等部分國家已開始實施以發(fā)現(xiàn)-撲殺為主的根除計劃，但這種手段不適用于我國的國情，導致該病在我國廣泛流行。

微小RNA(microRNA或miRNA)是一種廣泛存在于動物、植物等基因組中的微小非編碼RNA[4]。miRNAs調控人類近30%基因的表達，并且參與幾乎所有真核生物的生理和病理過程[5]。同時，隨著miRNA高通量測序平臺日新月異的變化，許多疾病異常表達的miRNAs被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，靶基因的預測和鑒定成為miRNAs功能研究的一個新切入點。

本研究在基于二代高通量測序建立的BVDV感染MDBK細胞miRNAs差異表達譜(Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫登錄號GSE61251)的基礎上，篩選出表達量顯著差異的miRNAs，并應用RT-qPCR和病毒滴度測定等方法驗證miRNAs對BVDV復制的影響，為利用miRNAs建立防控BVD的新技術提供理論依據(jù)，并為后續(xù)的抗病毒研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、細胞與病毒 含BVDV NADL全長cDNA的pACNR/NADL質粒，由美國洛克菲勒大學Charles M Rice友情惠贈；BVDV NADL毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；HEK-293FT和MDBK細胞均購自中國科學院上海細胞庫，并使用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；大腸埃希菌DH5α，由石河子大學動物疫病防控兵團重點實驗室保存；雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)載體pmirGLO，為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 LightCycler 480型RT-qPCR儀，Roche公司產(chǎn)品；核酸定量儀Nanodrop 2000c、二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；DYY-4C型高壓雙穩(wěn)電泳儀電源、DYCZ-24A型雙垂直電泳儀和DYCP-40C型半干式碳板轉印儀，北京六一公司產(chǎn)品；TE2000型熒光倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；PowerWave HT型酶標儀，Biotek公司產(chǎn)品；TECAN SUNRISE型酶標儀，TECAN公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 bta-miR-205-Antagomir(bta-miR-205的抑制劑片段)、bta-miR-205-agomir(bta-miR-205的成熟片段)、bta-miR-497-Antagomir(bta-miR-497的抑制劑片段)、bta-miR-497-agomir(bta-miR-497的成熟片段)、Stable negative control(陰性對照)均由上海吉瑪制藥公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E1910)，Promega公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000，Invitrogen公司產(chǎn)品；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清和DMSO，Gibco公司產(chǎn)品；SYBR Green Master Mix試劑盒，Roche公司產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒，北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品；TRIzol細胞裂解液、TryPLE和NEAA，Life Tec公司產(chǎn)品；General AllGen kit(通用型柱式基因組提取試劑盒)、無內毒素大提質粒試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；其余分子生物學試劑，上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 靶向BVDV NADL全基因組的miRNA預測 BVDV與丙型肝炎病毒(Hepatitis c virus，HCV)在基因組結構上具有高度相似性，同時靶向于HCV基因組的miRNAs的種類和功能研究報道較為豐富。因此，首先使用Target Scan軟件搜索HCV感染人后差異表達的miRNAs，并且在miRBase數(shù)據(jù)庫中找到相應的miRNAs序列；將該miRNAs序列與前期建立的BVDV感染MDBK細胞miRNAs差異表達譜進行比對分析，尋找與牛同源的miRNAs序列；然后使用TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測這些miRNAs在BVDV NADL基因組中的靶位點。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因載體的構建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中BVDV NADL基因組序列(登錄號NC-001461)，用Primer premier 5.0軟件設計擴增miRNAs靶向于NS5B的3′端序列及RT-qPCR檢測E0基因的引物，擴增靶向于NS5B 3′端基因的引物序列見表1(劃線部分為酶切位點)。

以pACNR/NADL質粒為模板，PCR擴增NS5B的3′端基因序列，PCR體系如表2所示。PCR條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s,64℃ 40 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果并回收目的基因；將回收產(chǎn)物與pMD 19-T載體進行過夜連接反應；連接產(chǎn)物熱激轉化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中；涂布于含氨芐青霉素的固體LB上，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h～16 h；挑取單克隆菌落置于含氨芐青霉素的液體LB中擴大培養(yǎng)4 h后，采用PCR方法鑒定單克隆菌落；將陽性的單克隆菌液送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序鑒定。

表1 擴增NS5B 3′端基因的引物

表2 PCR反應體系

將測序正確的菌液接種到20.0 mL含氨芐青霉素的液體LB中，搖菌培養(yǎng)12 h～16 h后，按照質粒小提試劑盒說明書提取重組質粒pMD19-T-NS5B-3′ end-1和pMD19-T-NS5B-3′ end-2；用核酸定量儀測定質粒濃度，用XhoⅠ和SalⅠ酶切重組質粒及雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)載體pmirGLO，酶切體系見表3，37℃水浴酶切4 h。

表3 雙酶切反應體系

用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物并使用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；按照表4反應體系進行酶切產(chǎn)物的連接；連接反應過夜后，將連接產(chǎn)物轉化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，并涂布到含氨芐青霉素的固體LB，靜置培養(yǎng)后挑取單克隆菌落、PCR鑒定、測序鑒定等步驟同上。

表4 連接體系

1.2.3 雙熒光素酶報告基因分析鑒定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因 按照無毒素質粒大提試劑盒說明書提取重組質粒pmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2；用核酸定量儀測量重組質粒的濃度和純度；按照1×104個/孔的密度將HEK-293FT細胞接種于明膠包被(每孔加入100 μL 1 g/L明膠溶液，靜置孵育過夜)的96孔細胞培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；待細胞匯合度達到80%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書將構建好的雙熒光素酶報告基因載體分別與bta-miR-205-Agomir/Antagomir、bta-miR-497-Agomir /Antagomir或negative control共轉染至HEK-293FT細胞，6 h后將培養(yǎng)基更換成含100 mL/L FBS的細胞完全培養(yǎng)液，此時刻記為轉染后0 h；轉染后36 h時，按照雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒說明書分別測量螢火蟲熒光活性和海參熒光活性，并按照如下公式計算相對熒光活性：

相對熒光活性=(試驗組螢火蟲熒光活性/試驗組海腎熒光活性)/(對照組螢火蟲熒光活性/對照組海腎熒光活性)

1.2.4 RT-qPCR檢測bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV NADL轉錄水平的影響 按照1.8×105個/孔的密度將MDBK細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板中；待細胞匯合度達到80%時，使用Lipofectamine 2000分別轉染bta-miR-205-Agomir/Antagomir、bta-miR-497-Agomir/Antagomir或negative control至MDBK細胞中，6 h后更換培養(yǎng)基為含100 mL/L FBS的細胞完全培養(yǎng)液，此時刻記為轉染后0 h；轉染后36 h時加入BVDV NADL分別感染4 h和8 h；加入TRIzol裂解液裂解細胞，提取細胞總RNA，將1 μg總RNA反轉錄成cDNA；使用RT-qPCR方法檢測BVDV NADL E0基因的轉錄水平變化[5]。

1.2.5 BVDV NADL感染miRNAs處理的MDBK細胞早期病毒滴度的檢測 按照如上方法接種MDBK細胞，并轉染bta-miR-205-Agomir/ Antagomir、bta-miR-497-Agomir/Antagomir或negative control；轉染后感染BVDV NADL；BVDV NADL感染后36 h時，反復凍融3次，收集病毒懸浮液，按Reed-Münch法測定病毒TCID50。

2 結果

2.1 bta-miR-205和bta-miR-497靶向BVDV NADL基因組的預測

用TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測bta-miR-205和bta-miR-497靶向BVDV NADL基因組可能的結合位點，結果如圖1所示。bta-miR-205和bta-miR-497能與BVDV NADL基因組中NS5B(RNA-dependent-RNA-polymerase，RdRp)序列以不完全互補的方式結合。

圖1 bta-miR-205和bta-miR-497在BVDV NADL基因組中的識別位點預測

2.2 重組雙熒光素酶報告基因載體的鑒定

雙酶切pmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2重組質粒，電泳結果出現(xiàn)3個條帶，分別是pmirGLO載體、NS5B-3′ end-1和NS5B-3′ end-2，大小分別為7 350、234、153 bp，與預期結果相符(圖2)。

1、6.PmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2重組質粒；2、3.酶切鑒定重組質粒pmirGLO-NS5B-3′ end-1；4、5.酶切鑒定重組質粒pmirGLO-NS5B-3′ end-2；M.DNA標準DL 10 000

1，6.PmirGLO-NS5B-3′ end-1 and pmirGLO-NS5B-3’end-2 recombinant plasmids,respectively; 2，3.Results of double enzyme digestion for pmirGLO-NS5B-3′ end-1; 4,5. Results of double enzyme digestion for pmirGLO-NS5B-3′ end-2; M.DNA Marker DL 10 000

圖2 重組雙熒光素酶報告基因載體酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant dual-luciferase reporter vector by double enzyme digestion

2.3 雙熒光素酶報告基因分析鑒定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因

用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測bta-miR-205和bta-miR-497是否靶向于BVDV NADL基因組的NS5B基因。結果如圖3所示，bta-miR-205-Agomir/ Antagomir、bta-miR-497-Agomir /Antagomir和Stable陰性對照分別與重組雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO-NS5B-3′ end-1和pmirGLO-NS5B-3′ end-2共轉染后，試驗組與對照組相比，相對熒光素酶活性并沒有顯著性的變化。表明bta-miR-205和bta-miR-497并不直接靶向于BVDV NADL基因組中的NS5B基因(表5)。

2.4 RT-qPCR檢測bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV轉錄水平的影響

MDBK細胞分別轉染bta-miR-205-Agomir/Antagomir、bta-miR-497-Agomir /Antagomir和Stable 陰性對照后感染BVDV NADL株，分別于感染后不同時間段，收集細胞提取總RNA，反轉錄成cDNA，用RT-qPCR檢測bta-miR-205和bta-miR-497對BVDV轉錄水平的影響。結果如圖4所示，與轉染negative control相比，轉染后4 h和8 h，轉染bta-miR-205 agomir能顯著降低BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，轉染bta-miR-205-antagomir能顯著升高BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，表明bta-miR-205 agomir可抑制BVDV的復制。轉染bta-miR-497 agomir能顯著升高BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，轉染bta-miR-497-antagomir能顯著降低BVDV NADL E0 基因mRNA水平(P<0.01)，表明bta-miR-497 agomir促進BVDV的復制。

圖3 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析bta-miR-205和bta-miR-497的靶位點

2.5 BVDV NADL感染miRNAs處理后的MDBK細胞早期的病毒滴度的檢測

MDBK細胞分別轉染bta-miR-205-agomir、bta-miR-497-agomir 和 Stable陰性對照后感染BVDV NADL，感染36 h后收集病毒懸液，用Reed- Münch法計算病毒懸液的TCID50。結果如表6所示，與陰性對照轉染的陰性對照組相比，轉染bta-miR-205-agomir能抑制病毒的復制，而bta-miR-497-agomir轉染后則促進病毒的復制。

3 討論

miRNA是一類長度約為22 nt的內源性單鏈非編碼小RNA，它可以通過誘導靶基因mRNA的降解或轉錄后基因沉默來負向調節(jié)基因的表達，所以miRNA在細胞增殖、分化和死亡等一系列生理病理過程中起關鍵的調控作用[5-6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與病毒感染、復制和包裝等過程之間存在密切關系，影響著病毒的復制、免疫逃逸及宿主抗病毒等過程。通過對miRNA和病毒相互作用的研究，可以為病毒感染診斷及治療提供新的策略[7]。

表5 相對熒光活性

注：同行數(shù)據(jù)后標相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:Data with same letters indicate no significant difference (P>0.05).

表6 病毒懸液滴度測定

miRNA可以調節(jié)抗病毒免疫，有些可以抑制病毒的復制[8]，有些可能被病毒利用，促進其復制。Zheng S Q等[9]發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒感染宿主時，宿主細胞編碼的miR-101的表達量增加，會抑制ATP 5B的活性，減少細胞內ATP的產(chǎn)生，從而影響病毒的復制。Wen B P等[10]發(fā)現(xiàn)宿主細胞編碼的miR-23b可通過作用于腸道病毒71型的3′UTR保守序列從而抑制EV71的復制。Li S等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-130通過恢復宿主先天免疫反應或下調pro-HCV miR-122的表達來抑制丙型肝炎病毒復制。Fang J等[12]發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染的A549細胞及流感患者外周血單核細胞(PBMC)中，miR-29的表達上調了近50倍，并且miR-29可以抑制DNA甲基轉移酶(DNMT)的活性，從而誘導環(huán)氧化酶2(COX2)的表達，增強抗病毒的作用。然而，肝臟中特異性表達的miR-122有利于HCV的復制[13]。Jopling C L等[14]發(fā)現(xiàn)miR-4661可以直接靶向與IFN-α基因的mRNA的3′UTR，從而抑制皰疹性口炎病毒(VSV)和仙臺病毒(SeV)感染所引起的巨噬細胞和樹突狀細胞抗病毒免疫反應，從而促進病毒的復制。

多項研究表明，宿主編碼的miRNAs不僅可以通過間接作用調控病毒的復制，也可以直接靶向于病毒的某些結構蛋白基因或非結構蛋白基因，從而影響病毒的復制。本文預測到bta-miR-205和bta-miR-497這兩個miRNAs可能直接靶向于BVDV NADL基因組中NS5B基因，通過雙熒光素酶報告基因試驗得出bta-miR-205和bta-miR-497并不靶向于NS5B。BVDV NADL株侵染轉染bta-miR-205和bta-miR-497后的MDBK細胞，試驗結果表明，bta-miR-205抑制病毒的復制，bta-miR-497促進病毒的復制。至于bta-miR-205和bta-miR-497如何影響病毒的復制，它們作用的部位和方式是什么？后續(xù)的工作中將會繼續(xù)研究。

“**”表示差異顯著，P<0.01。

“**”means significant difference，P<0.01.

圖4 RT-qPCR檢測BVDV NADL E0的轉錄水平

Fig.4 Detection of BVDV NADL E0 transcription levels by real-time quantitative PCR

BVDV感染及在細胞內的復制是病毒與宿主細胞之間相互作用、相互協(xié)調的結果，目前BVDV感染動物后，沒有有效的治療方法，也沒有有效的疫苗可以用來免疫動物。因此，有必要尋求新的、安全有效的抗病毒治療策略。研究表明，miRNA在調控病毒復制方面扮演著非常重要的角色，所以對有效miRNA的篩選和深入研究十分迫切。其研究結果將有助于闡明BVDV的致病機制，同時還可以為BVDV感染的治療提供新的分子靶標。

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Study on Replication of Bovine Viral Diarrhea Virus Regulated by bta-miR-205 and bta-miR-497

LIU Sheng1,MENG Lu-ping1,ZHANG Hui1,FU Qiang2，SHI Hui-jun2，CHEN Chuang-fu1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China)

In order to explore the regulation effect of bta-miR-205 and bta-miR-497 on the bovine viral diarrhea virus(BVDV)' replication,based on the established miRNAs' differential expression profile of BVDV infected MDBK cells,the bta-miR-205 and bta-miR-497 with significantly different expressions were selected. The target genes of bta-miR-205 and bta-miR-497 were identified by the methods of bioinformatics software prediction and luciferase reporter gene verification. The effects of bta-miR-205 and bta-miR-497 on BVDV replication were verified by qRT-PCR and virus titer assay. The results showed that bta-miR-205 significantly inhibited the replication of BVDV, and bta-miR-497 significantly promoted the replication of BVDV. The study provided a new idea and basis for establishing a new technology to control BVDV.

Bovine viral diarrhea virus; bta-miR-205; bta-miR-497; replication

2016-06-20

國家自然科學基金項目(U1303283,31502095,31560328)；國際科技合作項目(2013DFR30970)

劉 升(1992-)，女，安徽蕭縣人，碩士研究生，主要從事分子病毒學研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)01-0015-06