張麗娜 顧恪波 吳潔 孫岸弢 張晨 張明輝

·綜述與講座·

白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制

張麗娜 顧恪波 吳潔 孫岸弢 張晨 張明輝

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然可食用的多酚類化合物，主要來源于葡萄、漿果、花生以及虎杖等多種植物的塊根提取物，其中虎杖在我國具有悠久而重要的藥用歷史。近年大量報道表明，Res具有一定的抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。然而其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚未完全闡明。據(jù)近年來諸多研究結(jié)果，本文對白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制作一簡單綜述，以供研究者參考。

白藜蘆醇；腫瘤；凋亡；機(jī)制；綜述

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然可食用的多酚類化合物，主要來源于葡萄、漿果、花生以及虎杖等多種植物的塊根提取物，其中虎杖在我國具有悠久而重要的藥用歷史。近年大量報道表明，Res具有一定的抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。然而其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚未完全闡明。據(jù)近年來諸多研究結(jié)果，本文對白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制作一簡單綜述，以供研究者們參考。

1 增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，啟動內(nèi)源性凋亡信號

近年來，大量研究證實(shí)ROS可通過多種途徑導(dǎo)致線粒體功能障礙，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換通道(permeability transition pore，PTP)在病理狀態(tài)下開放，將細(xì)胞色素C(cytochromr C)和其他促凋亡因子釋放到胞質(zhì)中，激活半胱氨酸蛋白酶3 (caspase-3)，從而引起瀑布效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。然而，腫瘤細(xì)胞通常顯示出高于正常水平的ROS含量，這不僅能促使腫瘤進(jìn)展、侵襲，而且可使腫瘤細(xì)胞更容易受到進(jìn)一步的ROS傷害[2]。事實(shí)上，目前許多抗腫瘤藥物正是通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激殺死腫瘤細(xì)胞，盡管它們有時既針對腫瘤細(xì)胞，也作用于正常細(xì)胞。

但是作為一種天然可食用的、無毒無公害的植物提取物，Res及其類似物Pterostilbene(PTE)可通過增加ROS含量，強(qiáng)化氧化應(yīng)激，降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)，在人肺腺癌A549、卵巢癌SKOV-3、多發(fā)骨髓瘤H929及彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞中啟動內(nèi)源性凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[3-6]。且這種ROS含量的增加，可能是通過觸發(fā)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2和JNK(c-Jun N-terminal kinase)等信號通路而實(shí)現(xiàn)的[5,6]。

2 參與對有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族ERK，p38和JNK激酶的調(diào)節(jié)

有絲分裂原激活的MAPK信號通路涉及多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，并參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。最初被發(fā)現(xiàn)的MAPK成員是ERK1/2信號途徑，其磷酸化可啟動一系列底物，對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞分裂及分化進(jìn)行調(diào)節(jié)。

相較于ERK1/2，p38和JNK激酶在MAP3K水平上具有較多的共有激活劑，一些MAP2K也能同時激活p38和JNK。而JNK和p38信號通路均參與應(yīng)對一些應(yīng)激性刺激，包括細(xì)胞因子、放射線照射、熱休克和滲透壓性休克等，并參與對應(yīng)激、凋亡和細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。

不過，JNKs也有許多專門的底物，只有JNKs才能將之磷酸化；而p38s也有一些特有的底物，以確保兩者在應(yīng)對應(yīng)激性刺激時的各自需要。

Res可以激活MAPK家族的兩個成員p38和JNK激酶，同時抑制另一成員ERK1/2的活性，從而在人慢性骨髓源性白血病K562細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡。它誘導(dǎo)位于Ser139的H2AX發(fā)生磷酸化，而H2AX的高表達(dá)可顯著增強(qiáng)Res誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡；突變的Ser139高表達(dá)(可以封閉H2AX的磷酸化)則可抑制Res誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡。這提示Res可能通過p38和JNK激酶調(diào)節(jié)的H2AX磷酸化誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡[7]。

3 上調(diào)過氧化物酶體增殖物啟動受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)水平

PPARγ屬于核受體超家族成員，是一個配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，其激活在各種腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致生長周期停滯和(或)細(xì)胞凋亡。

有研究顯示，Res作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，可激活PPARγ而抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡。而轉(zhuǎn)染顯性陰性的PPARγ突變體于相關(guān)結(jié)腸癌細(xì)胞，或治之以PPARγ拮抗劑，可反轉(zhuǎn)Res的抑制作用[8]。Res的同源合成物PTER-ITC作用于激素依賴性乳腺癌細(xì)胞MCF-7和非激素依賴性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后，均能調(diào)節(jié)PPARγ表達(dá)相關(guān)的基因，并增加PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)水平，運(yùn)用PPARγ拮抗劑或PPARγ siRNA預(yù)處理則可抑制PTER-ITC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。PTER-ITC是在PTER主體上添加一半異硫氰酸酯(isothiocyanate，ITC)而合成的，而PTER是二甲基化的Res同源物，其分子式為trans-3,5-dimethoxy-4'-hydroxystilbene。另外，該研究還表明，共同孵育于p38 MAPK或JNK的抑制劑，PTER-ITC介導(dǎo)的PPARγ上調(diào)就可以被抵消，說明p38 MAPK和JNK信號途徑均參與了PTER-ITC的作用[9]。此外，PTER- ITC還在PPARγ配體結(jié)合部位與5個極性的、8個非極性的殘基發(fā)生相互作用，對其活性的激活具有至關(guān)重要的作用。上述研究表明，PTER-ITC可能通過p38 MAPK和JNK信號途徑參與了PPARγ的激活，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

4 抑制磷酸化蛋白激酶PKB(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路

PI3K-AKT-mTOR信號通路已被證實(shí)是對腫瘤具有重要意義的三個主要信號通路之一。mTOR是PI3K/AKT的關(guān)鍵下游激酶，可以參與調(diào)解腫瘤細(xì)胞的增殖、成長、存活及血管生成。事實(shí)上，通過磷酸化，PI3K-AKT-mTOR可抑制促凋亡因子活性而激活抗凋亡因子活性。因此，抑制AKT/mTOR磷酸化是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的一個重要途徑。

有研究報道，HS-1793、Res的一種合成類似物，可以通過下調(diào)AKT的水平而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長，誘導(dǎo)其凋亡，并伴隨有形態(tài)學(xué)改變、二磷酸腺苷核糖多聚酶(poly ADP- ribose polymerase，PARP)裂解、Bax/Bcl-2比例改變和caspases 激活[10]。

此外，Res可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的DDX5，即DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box helicase 5，亦即p68的表達(dá)水平降低；而DDX5耗減可通過抑制mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)信號，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。

當(dāng)然，在AKT上游可能還存有其他調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，Res在膀胱癌T24和5637細(xì)胞中可降低miR21表達(dá)，減少AKT磷酸化，降低Bcl2蛋白表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而高表達(dá)的miR21可恢復(fù)AKT活性，下調(diào)Bcl2表達(dá)和Res誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]。說明Res可能通過miR21抑制Akt/Bcl2活性及表達(dá)，從而達(dá)到促凋亡作用。

5 激活A(yù)KT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a

FoxO3是AKT下游FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。Res在肝癌細(xì)胞系HepG2中可誘導(dǎo)凋亡，并伴隨有促凋亡蛋白Bim表達(dá)的增加，以及AKT調(diào)節(jié)的FoxO3磷酸化減少。而且，Res可使得核內(nèi)FoxO3a水平增加而通過Bim調(diào)節(jié)細(xì)胞核的死亡。因此，Res誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞HepG2凋亡可能是通過AKT調(diào)節(jié)的FoxO3磷酸化減少，增加促凋亡蛋白Bim表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[13]。

6 下調(diào)NF-κB活性

Res通過加強(qiáng)細(xì)胞間連接及下調(diào)NF-κB活性，抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)起到化療增敏作用，可以增強(qiáng)5-氟尿嘧啶(5-Fu)對結(jié)直腸癌的抑制效果[14]。而Res加載明膠納米粒子(RSV-GNPs)后，亦可通過下調(diào)NF-κB表達(dá)，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞凋亡[15]。

7 抑制JAK/STAT通路

Res可通過抑制JAK1、JAK2和Tyk2及其下游的調(diào)節(jié)因子STAT3和STAT5的磷酸化，從而抑制JAK2(V617F)突變的腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。這種對具有JAK2(V617F)突變的腫瘤細(xì)胞的選擇性效應(yīng)，比沒有JAK2(V617F)突變的腫瘤細(xì)胞更為突出。在來自于JAK2(V617F)突變的真性紅細(xì)胞增多癥患者提供的血樣中，Res也抑制了紅系祖細(xì)胞集落的形成。而且與選擇性的JAK2抑制劑ruxolitinib聯(lián)用，可協(xié)同加強(qiáng)其清除JAK2(V617F)突變腫瘤細(xì)胞的作用。這些證據(jù)表明，Res可通過抑制JAK2通路，選擇性地誘導(dǎo)JAK2(V617F)突變的腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。

另一項(xiàng)研究也證實(shí)，Res可持續(xù)抑制四種NK細(xì)胞系，即KHYG-1、NKL、NK-92和NK-YS的STAT3活性及JAK2磷酸化，但對STAT3活性有影響的其他上游調(diào)節(jié)因子如PTEN、TyK2和JAK1等則無明顯調(diào)節(jié)作用；對STAT3下游的兩個抗凋亡效應(yīng)因子MCL1和survivin則具有下調(diào)的作用[17]。在惡性間皮瘤細(xì)胞MSTO-211H中，Res也通過下調(diào)MCL1蛋白水平，啟動生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并伴隨有procaspase-3裂解、底物PARP出現(xiàn)，caspase-3/7活性增強(qiáng)等效應(yīng)[18]。

8 激活Fas調(diào)節(jié)的凋亡途徑

另一種Res的合成類似物，(E)-8-acetoxy-2-[2-(3,4-diacetoxyphenyl)ethenyl]-quinazoline(8-ADEQ)，可以通過增加ROS產(chǎn)生，增加Fas、Fas相關(guān)死亡死亡域(Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD)及FasL表達(dá)，促進(jìn)死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death- inducing signaling complex，DISC)形成，在人白血病HL-60細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡，并伴隨有MMP降低，細(xì)胞色素C釋放，以及caspases-8、caspases-9、caspases-6和caspases-3的激活，及其底物PARP的裂解[19]。

9 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)

丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2，PKM2)在各種腫瘤細(xì)胞中往往呈現(xiàn)非正常的高表達(dá)狀態(tài)，并促進(jìn)腫瘤生存。Res可通過降低PKM2表達(dá)水平，來增加(ER stress)蛋白及線粒體分裂蛋白(mitochondrial fission proteins)的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的活性，降低融合蛋白(fusion proteins)的水平。這種現(xiàn)象可被人為地高表達(dá)PKM2所逆轉(zhuǎn)。而實(shí)驗(yàn)中，隨著Res的干預(yù)microRNA-326 (miR-326)表達(dá)升高，若予miR-326模擬物干預(yù)則能降低PKM2水平，且促進(jìn)ER stress及線粒體分裂的恢復(fù)。因此，miR-326/PKM2調(diào)節(jié)的ER stress和線粒體功能紊亂可能參與了Res誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。

此外，CSTMP，一種TMP與Res衍生物的合成制劑，可以顯著誘導(dǎo)人骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226凋亡，也是通過增加ER stress相關(guān)蛋白如CHOP、GRP78、GRP94、裂解的caspase-12等表達(dá)，提高相關(guān)ER stress信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子PERK- eIF2α、IRE1α和ATF6活性而達(dá)成的。若通過siRNA抑制CHOP，就能顯著抑制CSTMP誘導(dǎo)的凋亡，提示CSTMP可能是通過CHOP依賴的ER stress途徑誘導(dǎo)線粒體功能紊亂及凋亡的[21]。

10 調(diào)節(jié)Notch1信號通路

有研究認(rèn)為，下調(diào)Notch-1抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，此效應(yīng)可能與激活A(yù)kt-mTOR和NF-κB信號通路有關(guān)[22,23]。而Res可誘導(dǎo)功能性的Notch1蛋白表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激活相關(guān)通路。在兩種甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)細(xì)胞系HTh7和8505C中，Res干預(yù)均可通過S期阻滯及誘導(dǎo)凋亡抑制其增殖，而且Res干預(yù)促進(jìn)甲狀腺特有的基因包括TTF1、TTF2、Pax8以及鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symporter，NIS)的表達(dá)上調(diào)；通過siRNA靜默Notch1后，則可導(dǎo)致Res誘導(dǎo)的NIS表達(dá)反向降低。說明Res抑制ATC細(xì)胞生長及促進(jìn)其再分化依賴于Notch1信號的激活[24]。

綜上所述，白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要通過：(1)增加ROS含量，啟動內(nèi)源性凋亡信號；(2)參與對MAPK家族ERK、p38和JNK蛋白激酶的調(diào)節(jié)；(3)上調(diào)PPARγ水平；(4)抑制AKT/mTOR信號通路；(5)激活A(yù)KT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a；(6)下調(diào)NF-κB活性；(7)抑制JAK/STAT通路；(8)激活Fas調(diào)節(jié)的凋亡途徑；(9)調(diào)節(jié)ER stress；(10)調(diào)節(jié)Notch1信號通路等途徑而達(dá)成，其作用靶點(diǎn)及調(diào)節(jié)機(jī)制十分多樣，作用于多種不同的腫瘤細(xì)胞也顯示了較好的促凋亡效果，研究前景十廣闊。

但目前總的來說，在細(xì)胞研究中的報道較多而動物及人體實(shí)驗(yàn)的報道較少，可能是由于白藜蘆醇的光敏感性及代謝不穩(wěn)定性限制了其充分利用[10]。盡管報道中也有白藜蘆醇的同源合成物的研究報道，但是其光敏感性是否有所改善，其穩(wěn)定性和干預(yù)作用是否能夠得到充分保存甚至是有所提高，目前未有報道的。另外，能否通過一些生物合成或修飾，提高其穩(wěn)定性及干預(yù)效果，也是今后需要深入研究的課題。另外，從不同植物中提取的白藜蘆醇含量是否穩(wěn)定，哪些植物可以為今后提供充分的藥源，這些問題也可能是今后需要進(jìn)一步研究和解決的。

1 Francesco A,Monica M,Mochael S.Mitochondria and reactive oxygen species.Hypertension,2009,53:885-892.

2 Gibellini L,Pinti M,Nasi M,et al.Interfering with ROS metabolism in cancer cells:the potential role of quercetin.cancers,2010,2:1288-1311.

3 Lucas IK,Kolodziej H.Trans-resveratrol induces apoptosis through ROS- triggered mitochondria-dependent pathways in A549 human lung adenocarcinoma epithelial cells.Planta Med,2015,81:1038-1044.

4 Dong J,Guo H,Chen Y.Pterostilbene induces apoptosis through caspase activation in ovarian cancer cells.Eur J Gynaecol Oncol,2016,37:342-347.

5 Xie B,Xu Z,Hu L,et al.Pterostilbene inhibits human multiple myeloma cells via ERK1/2 and JNK pathway in vitro and in vivo.Int J Mol Sci,2016,17:E1927.

6 Kong Y,Chen G,Xu Z,et al.Pterostilbene induces apoptosis and cell cycle arrest in diffuse large B-cell lymphoma cells.Sci Rep,2016,6:37417.

7 Wu XP,Xiong M,Xu CS,et al.Resveratrol induces apoptosis of human chronic myelogenous leukemia cells in vitro through p38 and JNK-regulated H2AX phosphorylation.Acta Pharmacol Sin,2015,36:353-361.

8 Aires V,Brassart B,Carlier A,et al.A role for peroxisome proliferator-activated receptor gamma in resveratrol - induced colon cancer cell apoptosis.Mol Nutr Food Res,2014,58:1785-1794.

9 Nikhil K,Sharan S,Singh AK,et al.Anticancer activities of pterostilbene- isothiocyanate conjugate in breast cancer cells:involvement of PPARγ.P LoS One,2014,9:e104592.

10 Kim DH,Kim MJ,Sung B,et al.Resveratrol analogue,HS-1793,induces apoptotic cell death and cell cycle arrest through downregulation of AKT in human colon cancer cells.Oncol Rep,2017,37:281-288.

11 Taniguchi T,Iizumi Y,Watanabe M,et al.Resveratrol directly targets DDX5 resulting in suppression of the mTORC1 pathway in prostate cancer.Cell Death Dis,2016,7:e2211.

12 Zhou C,Ding J,Wu Y.Resveratrol induces apoptosis of bladder cancer cells via miR21 regulation of the Akt/Bcl2 signaling pathway.Mol Med Rep，2014,9:1467-1473.

13 Liu MH,Lin XL,Li J,et al.Resveratrol induces apoptosis through modulation of the Akt/FoxO3a/Bim pathway in HepG2 cells.Mol Med Rep,2016,13:1689-1694.

14 Buhrmann C,Shayan P,Kraehe P,et al.Resveratrol induces chemosensitization to 5-fluorouracil through up-regulation of intercellular junctions,Epithelial-to- mesenchymal transition and apoptosis in colorectal cancer.Biochem Pharmacol,2015,98:51-68.

15 Karthikeyan S,Hoti SL,Prasad NR.Resveratrol loaded gelatin nanoparticles synergistically inhibits cell cycle progression and constitutive NF-kappaB activation,and induces apoptosis in non-small cell lung cancer cells.Biomed Pharmacother,2015,70:274-282.

16 Trung LQ,Espinoza JL,An DT,et al.Resveratrol selectively induces apoptosis in malignant cells with the JAK2V617F mutation by inhibiting the JAK2 pathway.Mol Nutr Food Res,2015,59:2143-2154.

17 Quoc Trung L1,Espinoza JL,Takami A,et al.Resveratrol induces cell cycle arrest and apoptosis in malignant NK cells via JAK2/STAT3 pathway inhibition.P Lo S One,2013,8:e55183.

18 Lee YJ,Lee YJ,Lee SH.Resveratrol and clofarabine induces a preferential apoptosis- activating effect on malignant mesothelioma cells by Mcl-1 down-regulation and caspase-3 activation.BMB Rep,2015,48:166-71.

19 Park EY,Kim JI,Leem DG,et al.Resveratrol analogue (E)-8-acetoxy-2-[2-(3,4-diacetoxyphenyl)ethenyl]- quinazoline induces apoptosis via Fas-mediated pathway in HL-60 human leukemia cells.Oncol Rep,2016,36:3577-3587.

20 Wu H,Wang Y,Wu C,et al.Resveratrol induces cancer cell apoptosis through miR-326/PKM2-mediated ER stress and mitochondrial fission.J Agric Food Chem,2016,64:9356-9367.

21 Sun X,Liao W,Wang J,et al.CSTMP induces apoptosis and mitochondrial dysfunction in human myeloma RPMI8226 cells via CHOP- dependent endoplasmic reticulum stress.Biomed Pharmacother,2016,83:776-784.

22 Zhao N，Guo Y，Zhang M，et al.Akt-mTOR signaling is involved in Notch-1-mediated glioma cell survival and proliferation Oncol Rep，2010，23:1443-1447．

23 Wang Z，Li Y，Banerjee S，et al.Down-regulation of Notch-1 and Jagged-1 inhibits prostate cancer cell growth，migration and invasion，and induces apoptosis via inactivation of Akt- mTOR and NF-kappaB signaling pathways.J Cell Biochem,2010,109:726-736．

24 Yu XM,Jaskula-Sztul R,Ahmed K,et al.Resveratrol induces differentiation markers expression in anaplastic thyroid carcinoma via activation of Notch1 signaling and suppresses cell growth.Mol Cancer Ther,2013,12:1276-1287.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.11.037

100053 北京市，中國中醫(yī)科學(xué)醫(yī)院廣安門醫(yī)院血液科

顧恪波，100053 北京市，中國中醫(yī)科學(xué)醫(yī)院廣安門醫(yī)院；

E-mail:gkbo74@163.com

R 917.7

A

1002-7386(2017)11-1725-04

2017-02-21)