鄭斌，徐普

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院·海南省口腔醫(yī)學中心口腔種植科，海南海口570208)

珍珠層生物性能及成骨誘導能力研究進展

鄭斌，徐普

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院·海南省口腔醫(yī)學中心口腔種植科，海南?？?70208)

珍珠層作為骨修復材料，具有誘導成骨作用、合適的降解性能以及良好的力學性能。文章綜述了珍珠層的結構及成分、細胞相容性和生物降解性及對前成骨細胞和骨髓間充質干細胞的成骨誘導作用，同時展望了其作為骨缺損修復材料的應用前景。

珍珠層；前成骨細胞；間充質干細；成骨誘導

牙周病、外傷、腫瘤和炎癥均可導致骨缺損，難以恢復的骨缺損困擾著成千上萬人，并且嚴重影響他們的生活質量。有些情況下，骨結構改變能影響人機體平衡。因此，適用于人體生物材料的研發(fā)顯得尤為重要，促進骨移植材料研發(fā)水平不斷提高。目前，來源于人的異體骨和動物的異種骨因不受供應限制而被廣泛使用，但存在著介導免疫反應的危險[1]。人工骨替代異體骨或異種骨避免了不良反應出現(xiàn)，具有良好的應用前景。Lopez等[2]于1992年發(fā)現(xiàn)貝殼珍珠層具有良好的生物相容性和成骨誘導性，促進了人工骨修復材料應用研發(fā)進展。相繼其他學者發(fā)現(xiàn)，珍珠層能夠在體外實驗環(huán)境中誘導成骨細胞增殖和礦化，進一步確定其成骨誘導性[3-5]。珍珠主要由珍珠層組成，比貝殼珍珠層含有更多的有機基質和微量元素[6]，并且產量豐富，引起了較多學者的關注，期望珍珠能有更好的成骨誘導性能。文章從珍珠層的理化特性、生物性能及成骨誘導方面展開綜述。

1 珍珠層結構及包含成分

珍珠層具有典型的“磚-泥”結構，即文石板片呈層狀分布，板片之間為有機質。對文石板片進一步觀測發(fā)現(xiàn)，它的結構單元并不是一個完整的單晶，而是納米晶粒的聚集體，晶粒周圍都包裹有機基質，整個板片就是一個有機-無機復合的“偽單晶”[7]。顯微結構下發(fā)現(xiàn)了文石板片中礦化橋的存在，位于文石板片層之間，表現(xiàn)為“磚-橋-泥”的結構，進一步認識了珍珠層結構[8]。Rousseau等[9]利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)觀察到了這種納米晶粒的存在，平均大小約45 nm。納米顆粒被鑲嵌到連續(xù)網狀有機質框架中，并且每個納米顆粒是獨立的，相互間無直接接觸；同時，通過高倍透射電子顯微鏡觀測到了有機質橋的存在。文石晶型碳酸鈣構成貝殼珍珠層和珍珠主要無機成分，約占總量的95%，還包含Na、K、Mg、Cu、Fe、Zn等多種微量元素[10]；有機成分近似5%主要為蛋白質。研究表明，珍珠層EDTA提取出的可溶蛋白質可以在體外實驗中誘導文石和球文石晶體定向生成，并且具有相同多晶相和形態(tài)；而不可溶蛋白對晶體聚集密度、大小數(shù)量有影響[11]。學者們進一步從珍珠層中純化分離出一些蛋白質，進行更深入的研究分析。多項研究表明它們能調控CaCO3沉積速度及表面形態(tài)，調節(jié)與鈣離子結合狀況[12-16]。P10這種蛋白在生物礦化中不僅加速碳酸鈣晶體的成核，還促進堿性磷酸酶的活性，誘導成骨細胞分化[17]；P60作用于前成骨細胞和骨髓間質干細胞，促進礦化結節(jié)形成[18]；N16能誘導小鼠前成骨細胞分化及促進其生物礦化；抑制破骨細胞分化和骨組織吸收，對治療骨質疏松有較大應用潛力[19]。

2 珍珠層生物相容性及降解性

眾所周知，生物相容性是生物材料在組織工程中應用的基礎條件。納米珍珠粉細胞毒性試驗相關結果表明符合生物材料的細胞毒性要求，未見溶血反應、內刺激反應及體內毒性反應,可以初步的認為納米珍珠粉具有一定的血液和組織相容性[20]。有學者通過觀測珍珠和貝殼珍珠層磨片，羥基磷灰石片(模擬體液沉積制作)對新生小鼠成骨細胞增殖和分化的作用，發(fā)現(xiàn)細胞在珍珠片上的增殖更快，細胞外基質面積最大[21]。Gao等[22]對比了納米和微米珍珠粉生物利用率，表明納米珍珠粉生物利用率效果更好。Chen等[23]研究表明口服納米級珍珠粉未出現(xiàn)急性毒性反應，但長期慢性毒性反應有待于觀測。

生物材料體內降解性能是評價生物材料安全性的重要指標。骨修復材料充填于骨缺損區(qū)，其體內生物降解速率應和新骨改建形成相適應。由于珍珠層僅含有1%～5%的有機質，而骨組織含有22%左右有機質，造成珍珠層的持續(xù)吸收速率低于骨吸收速率，珍珠層降解慢可能影響骨改建過程[24]。對于珍珠層降解，也有學者認為破骨細胞降解珍珠層種植體的能力有限，其中珍珠層種植體大小、由光滑到粗糙的形態(tài)及周圍細胞環(huán)境是決定其生物降解的關鍵因素[25]。珍珠層粉粒徑的大小也是影響其降解的關鍵因素之一，湯勇智等[26]發(fā)現(xiàn)，納米級珍珠粉降解率高于微米級，骨修復能力也強于微米級。因此，珍珠層生物降解率與粒徑大小和形態(tài)相關，當珍珠層的粒徑逐漸變小，形態(tài)由光滑到粗糙，其降解吸收呈現(xiàn)上升的趨勢。

3 珍珠層對前成骨細胞成骨誘導

珍珠層植入人、羊和大鼠體內均能刺激骨形成細胞，促進新骨形成，未發(fā)現(xiàn)炎癥反應[3，27-28]。大量實驗表明，珍珠層水溶有機質(water-soluble organic matrix，WSM)才具備實際意義上的成骨誘導性，不僅能促進小鼠前成骨細胞向成骨細胞分化，而且誘導其礦化成骨[27，29-30]。珍珠層水溶有機質含有約110種有機分子，分子量從100～700 Da不等，含有多肽氨基酸，分子量低于1 kD的有機分子是珍珠層水溶有機質主要組成部分[31]。為了進一步認識珍珠層有機基質中的成骨相關因子，Mouriès等[32]用高效液相色譜法根據(jù)有機基質分子量大小劃分為SE1～SE4四段，其中相對分子量較小的SE4段成骨活性最明顯，能夠顯著促進MCR5細胞的ALP活性，與骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)作用相似，不同細胞略有不同。Moutahir-Belqasmi等[33]將WSM配成不同的濃度：1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL，研究對小鼠的成骨細胞作用，其中濃度為50 μg/mL的WSM對于ALP的增殖效果最好，100 μg/mL次之，余幾乎沒有影響，表明能促進細胞ALP增加的濃度為50～100 μg/mL。珍珠層水溶有機質對成骨有積極促進作用，同時對骨吸收也有影響，能促進前破骨細胞向破骨細胞分化，誘導破骨細胞吸收珍珠層基質，但吸收速度相比慢于骨的吸收，對破骨細胞有一定的抑制作用[34-35]。雖然珍珠層水溶有機質表現(xiàn)出良好的促成骨效應和破骨調控作用，但它畢竟是一種混合物，包含多種分子，珍珠層水溶有機質良好性能可能是多種分子共同作用的結果。

4 珍珠層對骨髓間充質干細胞成骨誘導及相關應用

珍珠層對前成骨細胞的體內外實驗均表明，WSM能釋放相關信號因子促進細胞成骨分化。有學者推測WSM信號因子也能影響骨髓間充質干細胞，使其向成骨細胞分化。在1999年Lamghari等[36]研究發(fā)現(xiàn)WSM在1.6 mg/mL時，大鼠骨髓間充質干細胞(rats bone marrow mesenchymal cells，rBMSCs) ALP活性明顯提高，同時在830 g/mL降低細胞增殖率，說明較高濃度WSM才能促進ALP活性增加，作用類似于BMPs。隨著研究進展，低濃度WSM及特定提取蛋白也表現(xiàn)出促成骨作用。Mouriès等[32]發(fā)現(xiàn)WSM在135 g/mL、270 g/mL和540 g/mL均增強骨髓間充質干細胞ALP活性，作用與地塞米松作用相似，同時能促進細胞增殖并且沒有表現(xiàn)出劑量相關性，而地塞米松對增殖幾乎沒有影響。也有研究表明WSM能影響相關成骨相關信號因子，尤其是在150～200 μg/mL時BMP-2的基因表達量增強，成骨誘導作用明顯，表現(xiàn)為兔BMSCs中堿性磷酸酶的活性提高，成骨細胞分化增強[37]。珍珠層提取蛋白P60能促進MC3T3-E1細胞和MSCs細胞周圍礦化結節(jié)的產生，在第8天左右均開始礦化，MSCs細胞礦化程度弱于MC3T3-E1細胞[18]。Green等[38]研究發(fā)現(xiàn)珍珠層片(500～750 μm)與人骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)，比rhBMP-2的成骨誘導性更強；EDTA提取的珍珠層可溶基質蛋白(nacre soluble protein matrix，SPM)尤其富含酸性天冬氨酸，具有良好的成骨誘導性，并能促進細胞增殖及骨鈣素的表達。

5 展望

珍珠層具有有機和無機完美結合的生物礦化結構，尤其是有機基質包含促進骨形成和骨改建主要信號因子，使珍珠層具有良好的成骨誘導潛能。大量實驗對珍珠層作為骨替代材料展開了深入研究，尤其是對前成骨細胞和髓間質干細胞的成骨誘導，但是珍珠層誘導成骨機制目前還沒有明確闡明。雖然相關文獻報道成骨因子存在于小分子量有機基質中，但具體調控因子及相關通路未完全明確，有待于進一步深入研究。珍珠層作為復合材料應用在復合支架材料中，能復合PLLA、PLGA、生物凝膠[39-41]等，表現(xiàn)出良好的生物相容性和安全性，具有可觀應用前景。珍珠層各方面的優(yōu)良性能也展現(xiàn)了珍珠應用潛力，尤其是納米級珍珠粉，期待進一步的深入研究。

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2016-12-06)

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海南省重點研發(fā)項目（編號：ZDYF2016018）；海南省海口市重點科技計劃項目-2013-58（編號：2013-SKG-06023）

徐普。E-mail：hnxupu@163.com