張興會，宋先忱，王世泉，劉孝剛，全治國，丁世偉，王家明，劉家歡（.遼寧省畜牧科學研究院，遼陽000；.錦州醫(yī)科大學，遼寧錦州000；.遼寧省遼寧絨山羊原種場有限公司，蓋州54）

疾病防控

兩種方法檢測絨山羊副結(jié)核的效果分析

張興會1，宋先忱1，王世泉1，劉孝剛2，全治國3，丁世偉3，王家明1，劉家歡2
（1.遼寧省畜牧科學研究院，遼陽111000；2.錦州醫(yī)科大學，遼寧錦州121000；3.遼寧省遼寧絨山羊原種場有限公司，蓋州115214）

為探明絨山羊副結(jié)核檢測方法的準確性，采用ELASA抗體檢測法和注射副結(jié)核提純菌素的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法進行了對比研究。結(jié)果表明：應(yīng)用副結(jié)核分支桿菌抗體檢測試劑盒測定的準確率可達到93%以上；采用測量皮厚差值的變態(tài)反應(yīng)法，對副結(jié)核感染初期的羊只篩查效果較好。

絨山羊；副結(jié)核；ELASA法；皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

羊副結(jié)核病是由耐酸的副結(jié)核分枝桿菌（MAP）引起的一種慢性腸炎，主要臨床癥狀是嚴重腹瀉，體重減輕，通常因采食被感染羊只糞便污物和飼料而感染此病。由于本病的潛伏期可達數(shù)月或數(shù)年，陽性羊只在成年前一般不表現(xiàn)發(fā)病癥狀。據(jù)最新調(diào)查統(tǒng)計，羊副結(jié)核在遼寧絨山羊主產(chǎn)區(qū)的感染率已超過10%，給絨山羊飼養(yǎng)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，已嚴重制約絨山羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。而當前，絨山羊養(yǎng)殖模式正向舍飼方向發(fā)展，與放牧方式相比飼養(yǎng)密度在加大，副結(jié)核病的防控形勢也十分嚴峻。羊副結(jié)核病沒有有效的治療方法，發(fā)病羊會持續(xù)消瘦至死亡，因此，盡早篩查出副結(jié)核陽性羊，阻斷傳染源是防控措施的關(guān)鍵所在。本項研究采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法和ELASA抗體兩種方法檢測副結(jié)核，以對比檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ELASA抗體檢測材料 負壓采血管，離心管，副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒（IDEXX），MAP抗原包被板，陽性對照液，陰性對照液，酶標抗體濃縮液，稀釋緩沖液，TMB底物液，終止液，濃縮洗滌液；未包被微量板，離心機，單道微量移液器，多道微量移液器，一次性移液吸頭，微量反應(yīng)震蕩器，蒸餾水，蓋板，96孔酶標儀。

1.1.2 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)材料 試驗用提純副結(jié)核菌素：批號201109，規(guī)格為每瓶3mL，失效期2016-11-09；4℃以下保存，30頭份，中國獸藥監(jiān)察所生產(chǎn)。75%酒精棉球，游標卡尺0～150mm，1mL蘭心注射器，注射針頭，剪毛剪，鑷子，等等。

1.1.3 試驗用羊 選自遼寧絨山羊聯(lián)合育種的成年母羊。

1.1.4 試驗時間及地點 時間：2015年4月至2016年8月。地點：遼陽市遼陽縣吉洞鄉(xiāng)。

1.2 分組

1.2.1 ELASA檢測方法 應(yīng)用副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒，對全場成年母羊先進行首測，篩選出MAP陽性羊、疑似羊和陰性羊，然后對不同結(jié)果的羊只抽檢，分階段跟蹤檢測，監(jiān)測其血清抗體水平變化。從2015年4月開始，首檢成年母羊317只，檢出陽性羊46只（1組）、疑似羊8只（2組）、陰性羊263只，從中選一圈羊計132只（3組）。對分組羊進行二檢和三檢。

1.2.2 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)測試 利用2015—2016年羊場開展的ELASA檢測結(jié)果，對參加皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)羊只進行分組：3個月內(nèi)兩次ELASA檢測陽性羊列為Ⅰ組，1個月內(nèi)首次檢測出的陽性羊為Ⅱ組，疑似羊為Ⅲ組，陰性羊列為Ⅳ組。通過接種提純副結(jié)核菌素，觀察其變態(tài)反應(yīng)，對比與ELASA檢測結(jié)果的符合度。

1.3 操作方法

1.3.1 ELASA法 每只母羊靜脈采血3mL，析出的血清用1m L離心管封裝、標記、冷凍。檢測副結(jié)核（MAP）抗體前12h，將離心管放置在0～4℃冰箱內(nèi)。在室溫（20±2）℃環(huán)境下，按操作說明提示，利用酶標儀，通過樣品的光密度值與陽性對照光密度的平均值相比較，診斷相關(guān)結(jié)果。每份樣品的計算樣品值設(shè)為S，陽性對照值設(shè)為P，計算樣品的S/P值。S/P值小于或等于0.45，判為MAP抗體陰性（-）；S/P值大于0.45、小于0.55，判為MAP抗體可疑（±），應(yīng)重新檢測；S/P值大于或等于0.55，判為MAP抗體陽性（+）。

1.3.2 提純副結(jié)核菌素測試法

1.3.2.1 注射部位 為尾根內(nèi)側(cè)，距肛門3 cm的中心部，先用卡尺測量注射前中央皮皺厚度，作好記錄。

1.3.2.2 注射劑量 不論大小羊只，一律皮內(nèi)注射0.1 mL。即將提純副結(jié)核菌素每支加生理鹽水3mL，皮內(nèi)注射0.1mL。凍干副結(jié)核菌素稀釋后當天用完。

1.3.2.3 注射方法 用75%酒精消毒術(shù)部，然后皮內(nèi)注入0.1mL提純副結(jié)核菌素，注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小泡，如注射有疑問時，應(yīng)另選向后的部位重作。

1.3.2.4 注射次數(shù)和觀察反應(yīng) 皮內(nèi)注射后經(jīng)72 h判定，仔細觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測量皮皺厚度，作好記錄。

1.3.2.5 結(jié)果判定 陽性反應(yīng)：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差等于或大于4mm以上者，其記錄符號為（+）；疑似反應(yīng)：局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差2.0～3.9mm之間，其記錄符號為（±）；陰性反應(yīng)：無炎性反應(yīng)，皮厚差在2mm以下，其記錄符號為（-）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用ELASA法二檢和三檢

采用ELASA法，在首檢后3個月進行跟測，發(fā)現(xiàn)46只陽性羊中3只轉(zhuǎn)陰，而疑似羊中轉(zhuǎn)陰和轉(zhuǎn)陽的羊各有3只，對首檢為陰性的132只母羊跟測結(jié)果為4只轉(zhuǎn)陽。在1個月后的三檢中發(fā)現(xiàn)，二檢中的50只陽性羊有2只轉(zhuǎn)陰，44只陰性羊中有1只轉(zhuǎn)為疑似。二檢中由首檢陽轉(zhuǎn)陰的羊只，在三檢也呈陰性，考慮與測定誤差有關(guān)。而首檢中的陰性羊后續(xù)出現(xiàn)的陽性羊只，應(yīng)是在首檢時屬感染最初期未檢測出有關(guān)。本統(tǒng)計結(jié)果表明，用ELASA檢測的可靠性應(yīng)達93%以上。

表1 E L ASA法跟蹤檢測結(jié)果

2.2 內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果

由表2可看出，ELASA檢出陽性超3個月的母羊，其皮厚差測量結(jié)果為陰性；新感染副結(jié)核的羊只，其皮厚差達8.56mm±3.21mm，與說明書判定標準一致，且極顯著高于其他各組（P＜0.01），其他各組間差異均不顯著（P＞0.05）。ELASA檢測為陰性的群體，按變態(tài)反應(yīng)測量結(jié)果顯示為疑似。表明采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)可篩選出在早期階段感染副結(jié)核的個體，隨著感染時間的延長，其皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)效果將不再明顯。

表2 絨山羊皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

3 討論與建議

（1）牛羊副結(jié)核病自1835年發(fā)現(xiàn)以來一直流行于世界各地。關(guān)于羊副結(jié)核的檢測方法曹敏慧等［1］采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出內(nèi)蒙古阿拉善羊副結(jié)核陽性個體。本研究驗證了在感染副結(jié)核初期的絨山羊，通過變態(tài)反應(yīng)可明確地篩選出受感染者，而隨著感染時間的延長，變態(tài)反應(yīng)的強度會變得不明顯，這應(yīng)是和感染初期免疫應(yīng)答反應(yīng)敏感度高有關(guān)。

（2對有副結(jié)核感染的羊群，可進行一次提純副結(jié)核菌素檢疫，將發(fā)病羊和新感染的羊篩查出后，迅速隔離，控制病源傳播?，F(xiàn)提純副結(jié)核菌素每頭份價格在15元左右，養(yǎng)殖戶基本能夠承擔，因此，當發(fā)現(xiàn)自家羊群有持續(xù)腹瀉、藥物治療無效的羊增多時，有必要進行變態(tài)反應(yīng)檢測。而對于規(guī)?；姆N羊場，需采用ELASA法，對場內(nèi)成羊檢測，及時挑出陽性羊。

（3）應(yīng)用ELASA法檢測副結(jié)核，準確度較高。但檢測每份樣品的成本費用在45元左右，適宜有經(jīng)濟條件的規(guī)模場。從隔離的陽性羊后續(xù)飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，在飼養(yǎng)管理條件較差的情況下，感染羊一年后的死亡率達60%。在中等以上的飼養(yǎng)水平下，70%以上的羊只不會有發(fā)病癥狀表現(xiàn)。無臨床癥狀的感染羊雖是傳播副結(jié)核病的根源，但對種用價值高的個體，還是先采取隔離觀察為宜。

（4）在遼寧絨山羊主產(chǎn)區(qū)，對該病防治建議采用以下措施：①及時淘汰發(fā)病羊，凈化羊群，規(guī)?；N羊場定期進行副結(jié)核篩查；②加強飼養(yǎng)管理，尤其在枯草期和母羊哺乳期，因此階段羊只體況和免疫力較差，感染后會迅速發(fā)??；③對非疫區(qū)養(yǎng)殖場最好堅持自繁自養(yǎng)，并定期接種副結(jié)核滅活苗，增強其免疫力；④定期用消毒劑對圈舍、食槽和飲水槽進行消毒，糞便作堆集發(fā)酵處理，病死畜無害化處理消滅傳染源［2］。

［1］曹敏慧，李國中，達能太.山羊副結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)診斷［J］.中國畜禽種業(yè)，2011（8）：128-129.

［2］王濤，吳星星，馬衛(wèi)平，等.羊副結(jié)核病的診斷報告［J］.中國畜禽種業(yè)，2016（1）：107.

S827.7

A

2095-3887（2017）01-0038-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.011

2016-11-23

遼寧省科學技術(shù)廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)及產(chǎn)業(yè)化項目（2015103036）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-40-15）

張興會（1972-），男，研究員，碩士，主要從事絨山羊繁殖與疫病防控技術(shù)研究工作。

宋先忱（1959-），男，推廣研究員。