劉宜勇，丁克奇，楊光維，劉建明，道爾基，團(tuán) 勇，吐來力江，陳春華（.新疆伊犁州畜禽改良站，伊寧835000；.新疆尼勒克縣畜牧獸醫(yī)站，尼勒克835700）

哈薩克羊多胎基因的多態(tài)性研究

劉宜勇1，丁克奇2，楊光維1，劉建明1，道爾基1，團(tuán) 勇1，吐來力江1，陳春華1
（1.新疆伊犁州畜禽改良站，伊寧835000；2.新疆尼勒克縣畜牧獸醫(yī)站，尼勒克835700）

為了探索綿羊多胎性的分子機(jī)理以及為綿羊繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供理論依據(jù)，采用PCR-RFLP及直接測序方法，對哈薩克羊群體BMP15基因FecXI和FecXH及第1內(nèi)含子進(jìn)行多態(tài)性檢測。結(jié)果表明：BMP15基因FecXI和FecXH酶切位點(diǎn)均未出現(xiàn)多態(tài)性，在第1內(nèi)含子存在2種基因型，AA型和AB型；優(yōu)勢基因型為AA型，優(yōu)勢等位基因?yàn)锳基因，多態(tài)信息含量小于0.25，屬于低度多態(tài)；χ2適合性檢驗(yàn)表明：處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；測序結(jié)果表明：AB型個(gè)體在該基因第1內(nèi)含子的第667位點(diǎn)發(fā)生G→T的突變，出現(xiàn)G/T的雜合。顯著性檢驗(yàn)分析表明：該突變位點(diǎn)在哈薩克羊群體中的產(chǎn)羔生產(chǎn)性能無顯著性差異（P>0.05）。

哈薩克羊；BMP15基因；PCR-RFLP；PCR-DS；多態(tài)性

綿羊的繁殖性能是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，在群體內(nèi)表現(xiàn)連續(xù)變異，是由一系列主基因或數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)決定的［1］，且遺傳力只有0.1左右，很難用常規(guī)的技術(shù)來提高。目前，國內(nèi)外提高綿羊繁殖性能最常見的方法是利用基因工程等技術(shù)進(jìn)行分子育種，從根本上改變其繁殖性能，而找到與繁殖性能相關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的基礎(chǔ)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的由卵母細(xì)胞分泌的一種生長因子，位于綿羊X染色體上，是一種在卵巢表達(dá)的卵母細(xì)胞衍生因子。BMP15可以通過和卵泡抑素的結(jié)合調(diào)節(jié)自身的生物活性，對早期卵泡的生長和分化起到重要調(diào)節(jié)作用。

目前在綿羊中發(fā)現(xiàn)了BMP15基因6個(gè)與繁殖力相關(guān)的突變。即FecXI、FecXB、FecXL、FecXH、FecXG和FecXR。其中任何一個(gè)突變雜合的所有母羊都表現(xiàn)有較高的排卵數(shù)，突變純合個(gè)體由于卵巢沒有初級卵泡而導(dǎo)致完全不育。Galloway等［2］發(fā)現(xiàn)了Inverdale綿羊BMP15基因的FecXI突變和Hanna綿羊BMP15基因的FecXH突變。Hanrahan等［3］在Belclare綿羊和Cambridge綿羊BMP15基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了FecXG突變，在Belclare綿羊BMP15基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了FecXB突變。Bodin等［4］發(fā)現(xiàn)了Lacaune綿羊BMP15基因的FecXL突變。Monteagudo等［5］和Martinez-Royo等［6］幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了BMP15基因與繁殖力相關(guān)的第6個(gè)突變，即西班牙Rasa Aragonesa綿羊BMP15基因第2外顯子第525～541位缺失17個(gè)核苷酸，根據(jù)BMP15基因突變的命名規(guī)則，該突變命名為FecXR。國內(nèi)學(xué)者對小尾寒羊和湖羊展開了BMP15基因的研究，發(fā)現(xiàn)高繁殖力的小尾寒羊發(fā)生了BMP15基因的FecXG突變，推測小尾寒羊的多胎性可能與該突變有關(guān)系。本試驗(yàn)以哈薩克羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）及直接測序法（PCR-DS）方法對BMP15基因進(jìn)行多態(tài)性檢測與分析，查找哈薩克羊在該基因酶切位點(diǎn)中的多態(tài)性，并對具有多態(tài)性的DNA片段進(jìn)行測序分析，以期在該基因中找到與哈薩克羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，為開展標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所需哈薩克羊（378只）由尼勒克縣提供。頸靜脈采血，ACD抗凝，供提取綿羊基因組DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》［7］以及常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 參照GenBank中綿羊BMP15基因（登錄號：NM_001114767），利用Olig6.0和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。

表1 檢測哈薩克羊多胎候選基因的引物

PCR擴(kuò)增體系為25μL，包括：10×PCR緩沖液2.5μL； 10 pmol/L引物0.5μL；dNTPs 2.0μL；2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL；100 ng/μL的DNA模板1.0μL，其余用水補(bǔ)齊至25μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增條件 94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性30 s；62～55℃退火30 s；72℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保存，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PFLP分析 5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物；1.5μL 10×Buffer；0.5μL限制性內(nèi)切酶；3μL水。

反應(yīng)條件：37℃水?。? h左右；3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并在凝膠成像儀上成像觀察結(jié)果，并保存。

1.2.5 產(chǎn)物回收與測序 根據(jù)RFLP分析結(jié)果，挑選出不同帶型的PCR產(chǎn)物各2個(gè)，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，并將回收后的產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

利用Chromas2、MEGA 5.05軟件進(jìn)行測序結(jié)果分析；使用Popgene Version 32生物軟件計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率、群體雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne），并檢驗(yàn)是否處于Hardy-Weinberg平衡；采用PIC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）值；利用SAS8.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 BMP15基因FecXH位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果 用FecXH位點(diǎn)的引物對哈薩克羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段與目的片段大小一致(240 bp（)圖1）。結(jié)果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

2.1.2 BMP15基因FecXI位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果 用FecXI引物對哈薩克羊基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段與目的片段大小一致（150 bp）（圖2）。結(jié)果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

2.2 PCR-RFLP結(jié)果

2.2.1 BMP15基因FecXH位點(diǎn)PCR-RFLP結(jié)果 用Spe I內(nèi)切酶對BMP15基因FecXH位點(diǎn)所擴(kuò)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測，得到240 bp條帶，顯示PCR產(chǎn)物沒有被酶切開（圖3）。

圖1 FecXH基因的PCR產(chǎn)物

圖2 FecXI基因的PCR產(chǎn)物

圖3 FecXH基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

2.2.2 BMP15基因FecXI位點(diǎn)PCR-RFLP結(jié)果 用Xba I內(nèi)切酶對BMP15基因FecXI位點(diǎn)所擴(kuò)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測，得到150 bp條帶，顯示PCR產(chǎn)物沒有被酶切開（圖4）。

圖4 Fe c X I基因的PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

2.3 直接測序分析

測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生型AA型和突變型AB型相比，在AB型個(gè)體中，BMP15基因第667位點(diǎn)有一個(gè)G和T的雜合（圖5）。

圖5 BMP15基因AA型和AB型測序結(jié)果比較

2.4 BMP15基因第1內(nèi)含子的群體遺傳學(xué)分析

通過對378只哈薩克羊樣本測序檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，221只多羔群體表現(xiàn)的優(yōu)勢基因型均為AA型，基因型頻率0.85，157只個(gè)體表現(xiàn)的AB基因型的頻率0.15。A基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因，基因頻率0.93，B基因的基因頻率0.07。群體雜合度（He）0.74、純合度（Ho）0.26、有效等位基因數(shù)（Ne）1.35、哈薩克羊多態(tài)信息含量0.22，屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25）。χ2值5.34，表明處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.5 不同基因型在哈薩克羊群體中分布的差異顯著性檢驗(yàn)

在不同產(chǎn)羔數(shù)的378只哈薩克羊群體的AA、AB兩種基因型與產(chǎn)羔數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，攜帶AA基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值（1.70±0.02）與AB型群體（1.76±0.03）間差異不顯著（P＞0.05），且前者小于后者。

3 討論

3.1 基因的遺傳特性

哈薩克羊BMP15基因的優(yōu)勢基因型為AA型，優(yōu)勢等位基因?yàn)锳基因，遺傳多態(tài)分析表明，多態(tài)信息含量小于0.25，屬于低度多態(tài)；χ2適合性檢驗(yàn)表明：處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明該地區(qū)自然選擇或者人工選擇對該基因分布的影響較小，在遺傳漂變、遷徙和人工選育等因素影響下保持動(dòng)態(tài)平衡。

3.2 基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的關(guān)系

近年來，國內(nèi)外關(guān)于綿羊BMP15基因多態(tài)性的研究報(bào)道比較多，且主要集中在對高繁殖力綿羊品種小尾寒羊和湖羊等品種的研究，而對于哈薩克羊突變位點(diǎn)多態(tài)性的研究報(bào)道比較少。本實(shí)驗(yàn)利用PCR-RFLP、PCR-DS方法，對哈薩克羊群體BMP15基因進(jìn)行了多態(tài)性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：哈薩克羊群體中BMP15基因FecXI和FecXH位點(diǎn)均未出現(xiàn)多態(tài)性，這與Galloway等［2］發(fā)現(xiàn)了Inverdale綿羊BMP15基因的FecXI突變和Hanna綿羊BMP15基因的FecXH突變結(jié)果有差異，可能是由于綿羊品種的繁殖力差異導(dǎo)致的。對BMP15基因第1內(nèi)含子多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，存在2種基因型，AA型和AB型，未發(fā)現(xiàn)變異純合體，這可能是被檢測的品種中B基因型突變頻率太低或者B基因?yàn)橹滤阑颍瑥亩沟脗€(gè)體不能存活［8］。測序結(jié)果表明：AB型個(gè)體在該基因第667位點(diǎn)發(fā)生G→T突變，出現(xiàn)G/T的雜合。本研究中發(fā)現(xiàn)的突變位于非編碼區(qū)，沒有引起相應(yīng)氨基酸序列的變化，但由于堿基序列發(fā)生了變化，因此會(huì)影響基因的翻譯速度，從而影響該基因的表達(dá)質(zhì)量，甚至?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮［9］。因此推斷，BMP15基因第667位點(diǎn)的突變可以作為控制綿羊繁殖力的潛在遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

本研究對378個(gè)不同產(chǎn)羔數(shù)的哈薩克羊樣本通過PCR-RFLP及直接測序法檢測BMP15基因的FecXH、FecXI位點(diǎn)及第1內(nèi)含子的多態(tài)性，結(jié)果表明，在FecXH、FecXI位點(diǎn)中不存在多態(tài)性，在第1內(nèi)含子的667位點(diǎn)出現(xiàn)G和T的雜合，但沒有發(fā)現(xiàn)突變純合體；相關(guān)分析表明，BMP15基因在第1內(nèi)含子的667位點(diǎn)的不同基因型AA和AB群體的產(chǎn)羔數(shù)之間差異不顯著（P＞0.05），需要進(jìn)一步通過擴(kuò)大群體進(jìn)行深入的研究。

［1］田秀娥，孫紅霞，王永軍.3個(gè)綿羊群體BMPR-15基因的遺傳多態(tài)性及其對產(chǎn)羔數(shù)的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），200911(37):31-36.

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Polym orphism of Fecundity Gene in Kazakh Sheep

Liu Yiyong1，Din Keqi2，Chen Chunhua1，etal
（1.The Livestock Improvement Station ofYili State，Yining 835000，Xinjiang，China；2.The Animal Husbandry and Veterinary Station of Nilka County，Nilka 835700，Xinjiang，China）

For exploring the molecular mechanism of prolificacy and providing theoretical basis for marker-assisted selection and breeding of fecundity in sheep，PCR-RFLP and sequence-based typing were used to detect polymorphism of BMP15 gene loci of FecXI，F(xiàn)ecXHand introns1 in Kazakh sheep.The results showed that AA and AB genotypes were found in introns1，Genotype AA was dominant genotype and allele A was dominant allele.The PIC of Kazakh sheep were low（PIC＜0.25）and in Hardy-Weinberg equilibrium byχ2 test.The sequencing analysis indicated that the sheep with AB genotype has G→Tmutation in coding region of 667 and existed the heterozygous of G/T.Significant test analysis showed that there was no significant difference between mutation groups in Kazak sheep.

Kazakh sheep；BMP15 gene；PCR-RFLP；PCR-DS；polymorphism

S826.2

A

2095-3887（2017）01-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.003

2016-12-13

哈薩克羊多胎（多羔）基因檢測項(xiàng)目

劉宜勇（1969-），男，高級畜牧師，研究生。研究方向：養(yǎng)羊生產(chǎn)。

陳春華（1987-），女，畜牧師，碩士研究生。研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。