周秀敏，李強子，畢英杰，任衛(wèi)合，張 麗（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

遺傳育種與繁殖

荷斯坦牛TLR6基因多態(tài)性分析

周秀敏，李強子，畢英杰，任衛(wèi)合，張 麗
（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

為研究中國荷斯坦牛TLR6基因的多態(tài)性，確定其等位基因數以及核苷酸變異位點，探討其遺傳特性，采用PCR-SSCP技術對303頭荷斯坦牛的TLR6基因進行了遺傳多態(tài)性檢測。結果表明：TLR6基因在擴增區(qū)域的209 bp處發(fā)生G→A的錯義突變，導致TLR6蛋白中第70位天冬氨酸（Asp）變?yōu)樘於０罚ˋsn），并產生AA、BB、AB三種基因型，基因型頻率分別為0.214 5、0.122 1和0.663 4，經χ2適合性檢驗，荷斯坦牛在該位點偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。說明中國荷斯坦牛TLR6基因多態(tài)性豐富，該位點可以作為荷斯坦牛抗病育種的分子標記位點。

荷斯坦牛；TLR6基因；遺傳多態(tài)性

TLRs是一類比較保守模式識別受體，能在微生物病原體感染機體早期做出免疫應答，是機體天然免疫防御中的重要因子［1］，可直接識別病原體的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），進而啟動免疫應答并建立獲得性免疫。TLR6作為TLRs家族一員，通過激活巨噬細胞、單核細胞等抗原遞呈細胞來對病原體做出免疫應答［2］。Vikki等［3］研究表明，TLR6不能直接識別病原體，而是作為輔助因子增強TLR2對某些病原體PAMPs的識別。研究發(fā)現，TLR6基因位于牛的第6號染色體上，包含2個外顯子和1個內含子［4］。李強子等［5］通過對TLR6基因生物信息學分析表明，該基因能對牛的抗病力和生產性能起作用。而TLR6基因也是奶牛乳房炎抗性相關的候選基因［6］。

近年來，國內對荷斯坦牛TLRs的研究大部分集中在TLR2和TLR4上，而對于TLR6的研究僅見儲明星［6］的相關研究。本實驗通過PCR-SSCP技術對荷斯坦牛TLR6基因進行多態(tài)性分析，旨在豐富荷斯坦牛TLR6基因庫，并為抗病性基因的篩選提供分子理論資料。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

血樣采自寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司的303頭中國荷斯坦牛，用醫(yī)用采血管尾靜脈采血10mL，-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法，從備用凍存血液樣本中提取總基因組DNA，去離子水溶解稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計與PCR-SSCP

根據GenBank中已公布的荷斯坦牛TLR6基因的mRNA序列（登錄號：NM_001001159），用Primer6.0軟件設計1對特異性引物，用于擴增荷斯坦牛TLR6基因序列。引物序列為：F：5′-CAACTTGACCCAACTGAAT-3′；R：5′-TTGTAAGCACGCTAAACTA-3′，引物由大連寶生物公司合成，擴增片段為241 bp。PCR擴增體系總體積為20μL：基因組DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Taq PCRMasterMix 10μL，ddH2O 6μL。PCR擴增程序：95℃預變性3min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，并采用1%瓊脂糖凝膠對其進行擴增結果檢測。

取3μL的PCR產物，加入7μL變性上樣緩沖液（0.025%溴酚藍、98%去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰），98℃變性10min后再立即冰浴10 min。將變性后的PCR產物點樣至10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上（Acr∶Scr=39∶1），160V電壓室溫電泳2～3 h。結束后用銀染法染色，確定PCR產物的基因型。PCR擴增產物經過SSCP確定基因型后，用試劑盒回收，對于純合子PCR產物送北京華大公司測序。對于雜合子個體，則參照Hu等［7］介紹的方法處理。

1.3 統計分析

使用BioEdit和Lasergene軟件分析測序峰圖并判斷突變位點及突變方式。利用Popgene32軟件計算出TLR6基因不同突變位點的等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數（Ne）、遺傳雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC），并對該位點基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及核苷酸序列的比對分析。

2 結果與分析

2.1 中國荷斯坦牛TLR6基因PCR擴增

對303頭荷斯坦牛的DNA樣品擴增后，經1%瓊脂糖凝膠（100V，30min）電泳檢測后均得到一條如圖1所示的特異性好、條帶清晰、長度約241 bp的PCR產物，且與預期目的片段大小一致。可以用于SSCP檢測。

圖1 荷斯坦牛TLR6基因PCR擴增產物檢測結果

2.2 中國荷斯坦牛TLR6基因PCR-SSCP檢測及序列測定分析

荷斯坦牛TLR6基因擴增序列區(qū)域共檢測到2種等位基因A和B，形成AA、BB、AB三種基因型（圖2），其中等位基因A和B均具有純合型個體。PCR產物純化后的測序結果顯示，擴增片段長度為241 bp，在GenBank中基因引物擴增區(qū)域核苷酸序列與牛TLR6基因序列的同源性為97%以上，這表明擴增產物的確為荷斯坦牛TLR6基因，而不是其他的TLR6基因。與普通牛TLR6基因（GenBank no.NM_001001159）序列對比發(fā)現，在擴增區(qū)域的209 bp處發(fā)生了堿基G→A的堿基突變（如圖3），使編碼蛋白質的氨基酸由酸性天冬氨酸（Asp）變?yōu)闃O性中性天冬酰胺（Asn）（如圖4）。

圖2 荷斯坦牛TLR6基因第3外顯子部分序列PCR產物SSCP檢測結果

圖3 荷斯坦牛和普通牛TLR6等位基因序列比對

圖4 荷斯坦牛和普通牛TLR6基因氨基酸序列比對

2.3 遺傳參數分析

統計分析結果表明，等位基因A和B的頻率分別為0.546 2和0.453 8，基因型AA、BB和AB的頻率分別為0.214 5、0.122 1和0.663 4。有效等位基因數（Ne）、遺傳雜合度（He）、純合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為1.983 1、0.663 4、0.336 6和0.372 9。PIC介于0.25和0.5之間，屬中度多態(tài)。經χ2適合性檢測表明，荷斯坦牛在該位點已偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

3 討論

近年來，國內外對TLR6基因的多態(tài)性報道相對較少。Kesh等［8］和Pierik等［9］在人的TLR6基因中共發(fā)現了4個SNPs。Opsal等［10］在挪威紅牛TLR6基因中發(fā)現了1個SNP。Shinkai等［11-12］在豬的TLR6基因中發(fā)現了11個SNPs。儲明星等［6］在荷斯坦牛TLR6基因中檢測到6個SNPs。魏麟等［13］在豬的TLR6基因中檢測到1個SNPs。Xiao［14］等在廣東人TLR6基因中發(fā)現了1個SNPs。

本研究在中國荷斯坦牛TLR6基因擴增序列區(qū)域檢測到G→A錯義突變，引起第70位非極性酸性天冬氨酸（Asp）變?yōu)闃O性中性天冬酰胺（Asn）。蛋白質的結構決定其功能，由于編碼蛋白質活性中心的大多數氨基酸殘基為非極性的疏水氨基酸，這些小基團位置的變化，很有可能改變該蛋白質的活性中心構象，甚至空間構象，因而會進一步影響其功能的發(fā)揮。但該研究中兩處發(fā)生替換的氨基酸的極性水平發(fā)生了改變，有可能導致其編碼蛋白質的高級結構發(fā)生改變，進而使荷斯坦牛的信號轉導、脅迫應答和免疫應答等的生理功能發(fā)生改變。

在遺傳多態(tài)性分析中，可以將有效等位基因數（Ne）、遺傳雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）作為衡量某群體遺傳變異大小的指標，其中指標數值越大，遺傳變異越高，選擇的潛力就越大。該荷斯坦牛群體在該位點表現為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），該突變位點已偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05），說明群體的遺傳變異較大，受到的選擇壓力相對較大，因此該位點可以作為荷斯坦牛泌乳性狀的分子標記位點。

［1］Buwitt-Beckmann U，Heine H，Wiesmüller K H，et al.TLR1-and TLR6-independent recognition of bacterial lipopeptides［J］.Journal of BiologicalChemistry，2006，281（14）：9049-9057.

［2］Jack C S，Arbour N，Manusow J，et al.TLR signaling tailors innate imune responses in humanmicrogliaand astrocytes［J］.The Journalof Immunology，2005，175（7）：4320-4330.

［3］Abrahams V M，Aldo P B，Murphy S P，et al.TLR6 modulates first trimester trophoblast responses to peptidoglycan［J］.The Journal of Immunology，2008，180（9）：6035-6043.

［4］McGuire K，JonesM，Werling D，etal.Radiation hybridmapping of all 10 characterized bovine Toll-like receptors［J］.Animal Genetics，2006，37（1）：47-50.

［5］李強子，朱國強，劉吳鑫，等.荷斯坦牛TLR6基因CDS區(qū)的生物信息學分析［J］.江蘇農業(yè)學報，2016，32（3）：608-614.

［6］儲明星，李春苗，石萬海，等.荷斯坦母牛TLR6基因多態(tài)性及其與體細胞評分關系的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2009，40（11）：1621-1629.

［7］Hu J，Zhou H，Smyth A，et al.Polymorphism of the bovine ADRB3 gene［J］.Molecular Biology Reports，2010，37（7）：3389-3392.

［8］Kesh S，Mensah N Y A A，Pelerlongo P，et al.TLR1 and TLR6 polymorphisms are associated with susceptibility to invasive aspergillosis after allogeneic stem cell transplantation［J］.Annals of theNew York Academy ofSciences，2005，1062（1）：95-103.

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Polym orphism of TLR6Gene in Chinese Holstein Cattle

Zhou Xiumin，LiQiangzi，Zhang Li，etal
（Collegeof Life Scienceand Engineering,NorthwestUniversity forNationalities,Lanzhou 730030,China）

Inorder tostudy thepolymorphism of TLR6gene in Holstein cattle,theblood samplesof303Holstein cattleweredetected bypolymerasechain reaction-singlestrand conformation polymorphism（PCR-SSCP）.The resultsshowed thattherewasamissense mutation ofG to A in the TLR6 gene,which led to the change ofaspartic acid to asparagine in the TLR6 protein,producing three genotypes（AA，BB，AB）with the frequenciesof0.2145，0.122 1and 0.663 4 respectively.Theχ2testindicated thatthegeneat this sitedeviated from Hardy-Weinbergequilibrium（P＜0.05）.Itwasconcluded that thepolymorphism of TLR6 genewas rich and the locuscould beused asamolecularmarker for resistancebreedingofHolstein cattle.

Holstein cattle；TLR6 gene；polymorphism

S826.2

A

2095-3887（2017）01-0001-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.001

2016-10-30

西北民族大學引進人才科研項目（xbmuyjrc201316）；西北民族大學生命科學與工程學院眾創(chuàng)空間扶持項目

周秀敏（1996-），女，在讀本科生。

作者通信：張麗，Email：shiningstar2013@sina.cn