李富強(qiáng) 王 偉 白宏英

1)南陽(yáng)醫(yī)專第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽(yáng) 473000 2)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部 南陽(yáng) 473000 3)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

腦缺血后處理對(duì)缺血再灌注腦組織細(xì)胞間黏附因子-1和髓過(guò)氧化物酶的影響

李富強(qiáng)1)王 偉2)白宏英3)

1)南陽(yáng)醫(yī)專第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽(yáng) 473000 2)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部 南陽(yáng) 473000 3)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

目的 探討腦缺血后處理對(duì)缺血再灌注損傷腦組織的保護(hù)機(jī)制。方法 將20只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血-再灌注組、缺血后處理組及延遲缺血后處理組。采用Longa大鼠MCAO模型方法，于缺血30 min、再灌注24 h后應(yīng)用2%氯化三苯基四氮唑染色檢測(cè)梗死體積，比色法檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶活性變化，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)的表達(dá)。結(jié)果 腦缺血后處理明顯減少腦梗死體積(P<0.05)，降低髓過(guò)氧化物酶活性(P<0.05)，可抑制缺血再灌注所誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；延遲腦缺血后處理組與缺血再灌注相比無(wú)明顯改變。結(jié)論 腦缺血后處理有腦保護(hù)作用，其保護(hù)作用有時(shí)間依賴性，可能通過(guò)抑制細(xì)胞間黏附因子-1活性和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)起到腦保護(hù)作用。

腦缺血后處理；腦缺血/再灌注損傷；髓過(guò)氧化物酶；細(xì)胞間黏附因子-1

大量研究表明，炎癥反應(yīng)參與腦缺血-再灌注損傷的過(guò)程，其中細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的激活、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵步驟，腦組織缺血刺激ICAM-1表達(dá)增加，在ICAM-1介導(dǎo)下白細(xì)胞、血小板等黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，損害內(nèi)皮細(xì)胞功能，造成神經(jīng)元損傷及血-腦屏障破壞，同時(shí)影響微循環(huán)，加重腦損傷[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，腦缺血后處理作為一種新的腦保護(hù)措施具有強(qiáng)大的腦保護(hù)作用，但其保護(hù)機(jī)制大多未知[2]。本研究應(yīng)用大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型，通過(guò)觀察腦組織中ICAM-1表達(dá)及髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的變化，初步探討缺血后處理潛在的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物模型 采用改良Longa大鼠MCAO模型[3]。按照3 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)10%水合氯醛腹腔注射方法麻醉，逐層分離肌肉、左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，分離并結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端；在頸外動(dòng)脈殘端前3 mm處剪一小孔，0.235 mm魚線殘端應(yīng)用酒精燈火焰燒灼成圓球形，經(jīng)頸外動(dòng)脈殘端前小孔處插入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插至大腦前動(dòng)脈水平，30 min后拔出魚線，恢復(fù)缺血區(qū)血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。術(shù)中大鼠體溫維持在37 ℃。再灌注24 h后參照Longa神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施功能評(píng)分，評(píng)分值達(dá)1～3分視為模型成功。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方法[3]清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)置于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血后處理組以及延遲缺血后處理組(n=20)。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程中僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，不插入線栓；缺血再灌注組：插入線栓30 min后拔出線栓實(shí)施再灌注；缺血后處理組：插入線栓30 min后拔出線栓再灌注時(shí)，立即實(shí)施30 s再缺血/30 s再灌注操作，反復(fù)實(shí)施3個(gè)循環(huán)；延遲缺血后處理組：插入線栓30 min后拔出線栓再灌注15 min后，再實(shí)施30 s再缺血/30 s再灌注操作，反復(fù)實(shí)施3個(gè)循環(huán)。每組取8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行腦梗死體積測(cè)定，6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行腦組織勻漿制備，6只動(dòng)物進(jìn)行ICAM-1 mRNA PCR測(cè)定。

1．3 腦組織勻漿的制備 將各組大鼠于再灌注24 h后斷頭處死，每組各6只。用冷生理鹽水沖洗，待腦組織表面血跡洗凈后，濾紙拭干后稱其質(zhì)量，取左側(cè)大腦組織依照腦組織：生理鹽水1：9比例加入冰生理鹽水，細(xì)致研磨后制成10%組織勻漿。上述制作過(guò)程需要在4 ℃條件下進(jìn)行。

1．4 腦梗死體積測(cè)定 大鼠腦缺血再灌注24 h后，立即斷頭、取腦(8只/組)。大鼠腦組織采用冠狀面每片(厚約2 mm)切片，腦組織切片浸入TTC溶液(溶度2%)中，放置于保溫箱37 ℃約30 min，未梗死腦組織呈玫瑰紅色，而梗死腦組織因無(wú)活性染色呈蒼白色。應(yīng)用10%福爾馬林溶液固定，數(shù)碼相機(jī)拍照后采用圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。梗死體積=(對(duì)側(cè)正常組織體積-同側(cè)正常組織的體積)/對(duì)側(cè)正常組織體積×100%[3]。

1．5 MPO活性的測(cè)定 10%大鼠腦組織勻漿，依照南京建成科技有限公司提供的MPO活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書方法，在460 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各組腦組織勻漿吸光度(A)值。按照說(shuō)明書計(jì)算出MPO活性數(shù)值。

1．6 腦組織ICAM-1 mRNA表達(dá)測(cè)定 每組各取6只大鼠，迅速斷頭取腦，取缺血半暗帶區(qū)組織，依照Trizol試劑盒提取RNA，紫外分光計(jì)檢測(cè)RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因：ICAM-1(NM_005107.4)引物序列：上游：5’- GGTATCCATCCATCCCACAG-3’，下游：5’- GCCACAGTTCTCAAAGCACA-3’；β-actin(NC_005100)上游：5’- CCCAGGTATTGTGCTGGACT-3’，下游：5’- GAAGGAATAGCCACGCTCAG-3’；PCR預(yù)增片段為208 bp、157 bp。上述引物由上海生工公司合成。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min 1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃時(shí)延伸4 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后產(chǎn)物放置于2%瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外透視儀進(jìn)行成像，D-140圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。依照計(jì)算公式取得相對(duì)值：目的基因ICAM-1表達(dá)強(qiáng)度/β-actin 的OD值表達(dá)強(qiáng)度反映ICAM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果

2．1 各組腦梗死體積比較 假手術(shù)組無(wú)腦梗死；與缺血后處理組相比，缺血再灌注組和延遲缺血后處理組腦梗死體積增加明顯(P<0.05)；延遲缺血后處理組和缺血再灌注組相比，腦梗死體積未見顯著差異(P>0.05)。見表1。

2．2 各組MPO的活性比較 假手術(shù)組MPO活性最低(P<0.01)；與缺血后處理組比較，缺血再灌注組與延遲缺血后處理組腦組織MPO活性顯著增加(P<0.05)；而延遲缺血后處理組和缺血再灌注組相比，腦組織MPO活性未見顯著差異(P>0.05)。見表1。

2．3 缺血后處理對(duì)腦組織ICAM-1表達(dá)的影響 假手術(shù)組腦組織中ICAM-1表達(dá)顯著低于其他各組(P<0.01)；與缺血再灌注組和延遲缺血后處理組相比，缺血后處理組腦組織ICAM-1表達(dá)降低明顯(P<0.05)；延遲缺血后處理組與缺血再灌注組相比，腦組織中ICAM-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積及腦組織MPO活性、

注：與缺血再灌注組相比，*P<0.05；與缺血后處理組相比，#P<0.05；與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與缺血再灌注組相比，#P>0.05

3 討論

2006年Zhao等[4]發(fā)現(xiàn)，腦組織再灌注時(shí)給予3個(gè)30 s缺血/再灌注循環(huán)顯著減少腦梗死體積，減少半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)，減輕缺血再灌注損傷等，結(jié)果表明，再灌注早期給予腦血流再?gòu)?fù)流干預(yù)措施可以減少再灌注損傷，然而其保護(hù)機(jī)制仍然未明。本研究結(jié)果表明，腦缺血后處理能明顯減小腦梗死體積，降低缺血腦組織的ICAM-1表達(dá)量及MPO活性。但延遲15 min的缺血后處理未能觀察到類似的表現(xiàn)。我們推測(cè)與缺血后處理可能影響缺血腦組織炎性介質(zhì)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，且時(shí)間因素與其保護(hù)作用具有相關(guān)性。

髓過(guò)氧化物酶是中性粒細(xì)胞生成的有嗜天青顆粒的過(guò)氧化物酶，存在于單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中；髓過(guò)氧化物酶活性升高是中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)增加的標(biāo)志。Barone等[5]證實(shí)，髓過(guò)氧化物酶活性能反映中性粒細(xì)胞在腦組織中浸潤(rùn)的程度，而且抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、黏附及釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，可以起到減少腦組織損傷的作用[6]。腦缺血后因缺氧呼吸鏈氧化磷酸化障礙，ATP合成減少，不能有效合成補(bǔ)充；線粒體功能進(jìn)行性惡化，呼吸鏈電子傳遞鏈?zhǔn)軗p，再灌注過(guò)程中電子漏出，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)。ROS可能使IKB蛋白磷酸化，而磷酸化后IKB蛋白喪失對(duì)NF-KB因子的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致NF-KB活化[7]。轉(zhuǎn)錄因子NF-KB是炎性表達(dá)的關(guān)鍵基因，與多種炎癥基因表達(dá)有關(guān)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、黏附分子等炎性基因、白細(xì)胞介素-1(IL-1)[8]。其中黏附分子中的細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)是影響中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)遷移重要炎性因子；在IL-1、TNF-α的誘導(dǎo)下，ICAM-1表達(dá)增加，促進(jìn)白細(xì)胞牢固黏附內(nèi)皮細(xì)胞表面，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入缺血組織[9]。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)缺血腦組織造成損傷的機(jī)制包括兩方面：(1)大量的中性粒細(xì)胞淤滯在微血管內(nèi)加重腦缺血，造成微循環(huán)障礙，即使缺血區(qū)血管再通缺血區(qū)仍無(wú)腦血流，即無(wú)復(fù)流現(xiàn)象(no-reflow)[10]；(2)中性粒細(xì)胞侵入缺血區(qū)后釋放大量的活性蛋白酶，損害缺血區(qū)神經(jīng)元，且中性粒細(xì)胞激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)，損壞血腦屏障，引起腦組織水腫[11]。

缺血后處理是一種應(yīng)用于腦缺血再灌注早期的干預(yù)措施，操作簡(jiǎn)單，在臨床治療中有潛在應(yīng)用價(jià)值?？傊X缺血后處理有明確的腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)而起作用，其保護(hù)作用有時(shí)間依賴性。

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(收稿2016-07-12)

Postconditioning attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting intercellular adhesion molecule-1 and myeloperoxidase activity

LiFuqiang*，WangWei，BaiHongying

*DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege，Nanyang473000，China

Objective To investigate the hypothesis that ischemic postconditioning may protect cerebral ischemic tissue．Methods Twenty healthy male Sprague Dawley rats were randomly split into 4 groups：sham group，ischemia-reperfusion group，ischemic postconditioning group，delayed ischemic postconditioning group．Modles of middle cerebral artery occlusion were established with the improved Longa-Zea method．Anesthetized rats underwent 30 minutes of ischemia and 24 hours of reperfusion．The volume of cerebral infarction size was identified with 2% triphenyl tetrazolium chloride(TTC) staining．Colorimetry was used to analyze the changes of myeloperoxidase activity．Real-time PCR was used to measure the expression ICAM-1．Results Postconditioning significantly reduced infarct size(P<0.05)，and myeloperoxidase activity(P<0.05)．Compared with ischemia-reperfusion group，postconditioning significantly inhibited the expression of ICAM-1．Nevertheless，delayed postconditioning didn’t have such benefit．Conclusion Postconditioning inhibits the expression of ICAM-1 and neutrophil infiltration to provide a potently anti-ischemic protection．

Ischemic postconditioning；Cerebral ischemic-reperfusion injury；Myeloperoxidase；Intercellular adhesion molecule-1

R-332

A

1673-5110(2017)03-0026-03