史慶玲, 董永彬, 周 強, 馬智艷, 喬大河, 鄧 飛, 李玉玲

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 小麥玉米國家重點實驗室, 鄭州 450002 2.河南省種子管理站, 鄭州 450016;

玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmERF1的克隆及表達分析

史慶玲1,2, 董永彬1*, 周 強1, 馬智艷1, 喬大河1, 鄧 飛1, 李玉玲1*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 小麥玉米國家重點實驗室, 鄭州 450002 2.河南省種子管理站, 鄭州 450016;

ERF類轉(zhuǎn)錄因子是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的下游響應(yīng)因子，參與乙烯調(diào)控的多種生理生化反應(yīng)。從玉米自交系丹232授粉后20 d的胚乳中克隆了一個ERF類轉(zhuǎn)錄因子ZmERF1，并對其進行了序列及表達分析。結(jié)果顯示，ZmERF1基因全長811 bp，ORF 690 bp，編碼230個氨基酸，包含一個典型的AP2結(jié)構(gòu)域,含有3個α-helix和1個β-sheets，亞細胞定位于細胞核中。進化樹分析表明該基因與單子葉高粱SbERF和水稻OsERF同源性較高。在體外原核表達系統(tǒng)中能夠檢測到重組蛋白His-ZmERF1，并用Western Blot驗證了所表達蛋白為重組蛋白，表明該基因具有體外活性。熒光定量PCR分析表明該基因在胚乳發(fā)育的前期表達量較少，后期(36 d)表達量較高。進一步對胚乳總蛋白的定量Western Blot分析，表明該蛋白在胚乳發(fā)育后期積累量高于發(fā)育前期。因此，初步推測玉米ZmERF1可能在籽粒胚乳發(fā)育后期發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果為了解該基因家族轉(zhuǎn)錄因子并進一步闡明其生物學(xué)功能提供了依據(jù)。

AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子；ZmERF1；熒光定量PCR；Western Blot

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與真核生物啟動子區(qū)域的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，能夠激活或抑制下游基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子。AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的、特有的并且起源古老的一類轉(zhuǎn)錄因子，其廣泛參與植物的生長發(fā)育及各種逆境脅迫應(yīng)答調(diào)控[1～4]。該轉(zhuǎn)錄因子家族的共同特點是其DNA結(jié)合域含有1～2個高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域，根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和結(jié)構(gòu)域的特點可將該類轉(zhuǎn)錄因子分為AP2(含有2個保守結(jié)構(gòu)域)和EREBP(含有1個保守結(jié)構(gòu)域)2個亞類，ERF類轉(zhuǎn)錄因子屬于EREBP類[5]。在擬南芥、水稻和玉米中分別發(fā)現(xiàn)了122個、139個和167個ERF類轉(zhuǎn)錄因子[6,7]。

ERF類轉(zhuǎn)錄因子作為AP2/EREBP家族的一個亞家族，主要參與生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，在干旱、高鹽和高低溫脅迫應(yīng)答以及植物發(fā)育、激素反應(yīng)等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用[8～10]。但不少研究發(fā)現(xiàn)該亞家族基因在種子、莖稈、葉片和幼苗中均有表達，表明該亞家族基因可能在植物的生長發(fā)育過程中起著更加廣泛的作用[11]，在植物的器官發(fā)育、細胞分裂、分化、花發(fā)育和果實成熟中均有相關(guān)研究[12,13]。在番茄中過表達Sl-ERF2基因能夠激活編碼甘露聚糖酶基因Sl-Man2，從而導(dǎo)致番茄未成熟種子提前萌發(fā)[14]；水稻基因Sub1A/C參與植物的生長代謝[15]；蘋果基因MdERF1/2與果實成熟有關(guān)[16]，但玉米中ERF亞家族基因的功能還沒有相關(guān)報道。

ERF類轉(zhuǎn)錄因子作為乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個關(guān)鍵的下游細胞核響應(yīng)因子，參與多種乙烯調(diào)控的生理生化反應(yīng)，對玉米籽粒的生長發(fā)育起著重要作用[17, 18]。因此，本研究從玉米自交系丹232中克隆了一個ERF類轉(zhuǎn)錄因子ZmERF1，氨基酸序列分析表明該基因?qū)儆贓RF類轉(zhuǎn)錄因子，并通過熒光定量PCR及胚乳總蛋白的Western Blot分析了該基因在籽粒不同發(fā)育時期的表達特征，為進一步克隆該家族其他基因及全面闡述其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取玉米自交系丹232為材料，2012年種植于鄭州河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)，行長4 m，行距0.67 m，每行17株。授粉后不同時期取樣，3個果穗為1個重復(fù)，剝?nèi)∷胫胁孔蚜；旌?，剝掉種皮和胚，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2ZmERF1基因克隆和生物信息學(xué)分析

利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中已知的ERF序列(GenBank登錄號：AY672654)設(shè)計引物(表1)。PCR擴增體系為(50 μL)：模板cDNA 1 μL，TaqHifi Buffer (10×) 5 μL，2.5 mol/L dNTP 2 μL，Primer-F(R) 1 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，ddH2O 39 μL；PCR程序為：95℃ 5 min；94℃ 50 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，34個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，由華大生物科技有限公司測序。利用軟件BioXM 2.6進行蛋白質(zhì)序列比對;cNLS Mapper分析基因核定位信號肽;SoftBerry (http://www.softberry.com/)在線分析基因亞細胞定位;Predict Protein (https://www.predict-protein.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的α-螺旋和β-折疊。利用Clustal W程序進行序列比對，利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining方法構(gòu)建ZmERF1與已知ERF蛋白的系統(tǒng)進化樹。

表1 實驗所用引物序列

1.3 熒光定量PCR分析

分別提取自交系丹232授粉后10 d、16 d、20 d、26 d、30 d、36 d和40 d的胚乳總RNA，純化后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，產(chǎn)物用于定量PCR擴增。根據(jù)ZmERF1基因的ORF序列設(shè)計引物(表1)，以玉米Actin基因為參照基因。反應(yīng)體系為(25 μL):12.5 μL 2× SYBR Premix ExTaq，引物2 μL，模板2 μL，超純水8.5 μL。反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，58℃ 30 s，共40個循環(huán)，每個反應(yīng)重復(fù)3次，通過比較Ct值來確定相對表達量。

1.4ZmERF1原核表達

利用引物YH-F與YH-R以保存的丹232重組質(zhì)粒pMD19-ZmERF1為模板，進行PCR擴增后與pEASY-E1表達載體連接，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。挑取陽性單克隆搖菌，當(dāng)菌液濃度OD600為0.6～1.0之間時，取出3 mL作為不加IPTG的空白對照，剩余的7 mL加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達。37℃誘導(dǎo)表達3～6 h后，利用10%的SDS-PAGE膠分離蛋白。

1.5 總蛋白提取

取-80℃冰箱中凍存的丹232不同發(fā)育時期的胚乳，在液氮中加PVPP研磨成粉末，用TCA-丙酮法提取總蛋白。蛋白濃度通過Bradford法測定，根據(jù)標(biāo)準曲線計算待測樣品的濃度，根據(jù)測定的濃度確定上樣量，最多45 μL，進行SDS-PAGE膠分離蛋白。

1.6 Western Blot分析

離心收集誘導(dǎo)表達的菌株蛋白和籽粒胚乳蛋白，用10%的SDS-PAGE膠分離蛋白，制作三明治轉(zhuǎn)化PVDF膜后，4℃過夜封閉PVDF膜。用含有0.5%脫脂奶粉的TBST稀釋一抗(兔多克隆抗體，華大)到合適濃度孵育PVDF膜，用TBST沖洗3次。帶有辣根過氧化物的羊抗兔IgG二抗(天根)1/10 000稀釋后孵育1 h，用TBST沖洗2次，用DAB顯色試劑盒顯色?？偟鞍椎腤B分析中一抗和二抗孵育大腸桿菌的誘導(dǎo)蛋白用化學(xué)熒光方法，在暗室中用X光片顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1ZmERF1克隆與序列分析

以玉米自交系丹232的籽粒cDNA為模板，PCR擴增并獲得ZmERF1基因序列，測序結(jié)果表明，自交系丹232中ZmERF1基因序列全長811 bp，其中ORF 690 bp (圖1)。

根據(jù)AP2/EREBP家族特征，ERF類基因?qū)儆诤幸粋€AP2保守結(jié)構(gòu)域的EREBP亞家族。結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明在自交系丹232中該基因編碼蛋白包含一個AP2結(jié)構(gòu)域(第57～120個氨基酸)，并含有3個α-螺旋和1個β-折疊；信號肽預(yù)測表明該基因編碼蛋白含有雙邊核定位信號肽，其中“IPARRRVSTADFWPGSEADAEDIHASHSPDP”為得分最高的一段信號肽，該蛋白主要在細胞核中發(fā)揮作用。利用軟件MEGA 4.0中Neighbor-Joining方法生成系統(tǒng)進化樹，表明ZmERF1屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與單子葉水稻OsERF和高粱SbERF基因具有較高同源性(圖2)。

2.2ZmERF1原核表達及Western Blot

將包含pEASY-E1-ZmERF1重組質(zhì)粒的BL21菌株挑取單菌落振蕩培養(yǎng)，ZmERF1重組蛋白在22～29 kDa之間有明顯蛋白表達量增加條帶(圖3A，彩圖見圖版二)，而生物信息學(xué)預(yù)測ZmERF1蛋白分子量大小約為24 kDa，加上6×His標(biāo)簽，表達的重組蛋白大小與理論計算值相符合；而誘導(dǎo)不加IPTG的空白對照時在22～29 kDa之間沒有蛋白表達量增加條帶，說明ZmERF1重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可以在BL21菌株中穩(wěn)定有效地表達。將經(jīng)過SDS-PAGE膠電脈后的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，用含有0.5%脫脂奶粉TBST稀釋的一抗孵育2 h，然后用帶有辣根過氧化物的二抗孵育1 h，用HRP-DAB試劑盒顯色，誘導(dǎo)表達的蛋白如圖3B所示。

2.3 玉米胚乳發(fā)育中ZmERF1的表達分析

對不同發(fā)育時期玉米胚乳中ZmERF1表達分析結(jié)果表明，在自交系丹232胚乳發(fā)育早期、中期ZmERF1表達量相對較低，發(fā)育后期表達量明顯升高，隨后下降但也高于前期(圖4A)。進一步對不同發(fā)育時期的胚乳蛋白進行定量Western BlotERF類亞家族成員在植物的生長發(fā)育、代謝、抵抗生物與非生物脅迫中都有重要作用。ERF亞家族是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的下游調(diào)控因子，當(dāng)植物受到逆境脅迫刺激時會激發(fā)體內(nèi)的信號級聯(lián)系統(tǒng)，乙烯的生物學(xué)合成被誘導(dǎo)，可以啟動其他相關(guān)基因進行應(yīng)激反應(yīng)而調(diào)控植物的生長分析，表明在自交系丹232胚乳發(fā)育后期(36 d)該蛋白含量也較多(圖4B)。

圖2 ZmERF1基因序列和進化樹分析結(jié)果Fig.2 Sequence analysis and phylogenetic trees of ZmERF1.A:AP2保守結(jié)構(gòu)域中3個α-螺旋和1個β-折疊 (E:α-螺旋; H:β-折疊)； B:SoftBerry在線預(yù)測自交系丹232中ZmERF1亞細胞定位； C:ZmERF1進化樹分析

圖3 ZmERF1基因原核表達分析 Fig.3 Prokaryotic expression analysis of ZmERF1.A.重組蛋白SDS-PAGE膠檢測；B.重組蛋白Western Blot分析(彩圖見圖版二)

3 討論

玉米是當(dāng)前第一大作物，在世界糧食安全中占有重要地位，提高玉米產(chǎn)量是解決糧食安全問題的一個重要途徑。玉米籽粒是代表性的貯藏器官，而胚乳是籽粒積累和貯藏營養(yǎng)物質(zhì)的場所，占籽粒重量的80%以上，胚乳細胞的發(fā)育、增殖和充實情況決定了籽粒的重量和品質(zhì)。因此，挖掘影響玉米籽粒發(fā)育相關(guān)基因?qū)ζ洚a(chǎn)量提高具有重要意義。

圖4 不同發(fā)育時期玉米自交系丹232胚乳中ZmERF1表達分析Fig.4 Expression analysis of ZmERF1 from endosperm of Dan232 in different development period.A.ZmERF1在發(fā)育胚乳中的表達分析; B.胚乳中ZmERF1的Western Blot分析

發(fā)育[19～21]。香蕉中ERFs類基因的研究表明，MaERF9和MaERF11在香蕉成熟的過程中呈現(xiàn)不同程度的表達模式，同時與乙烯合成基因MaACO1互作調(diào)節(jié)果實成熟[22]。

本研究從玉米籽粒中克隆了1個含有保守AP2結(jié)構(gòu)域的ERF類亞家族基因ZmERF1，該基因編碼序列全長690 bp，編碼230個氨基酸殘基，該序列包含1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域，并且含有3個α-螺旋和1個β-折疊，屬于ERF亞家族，通過亞細胞定位預(yù)測該轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中發(fā)揮作用。在授粉后10 d到30 d的玉米胚乳中，該基因的表達量相對比較平緩，隨著胚乳灌漿結(jié)束，開始脫水成熟，ZmERF1表達量明顯增加。但要明確ZmERF1在玉米籽粒發(fā)育和脫水成熟中的具體作用，還需要進一步研究。

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Cloning and Expression Analysis ofZmERF1 in Maize

SHI Qingling1,2, DONG Yongbin1*, ZHOU Qiang1, MA Zhiyan1, QIAO Dahe1, DENG Fei1, LI Yuling1*

1.NationalKeyLaboratoryofWheatandMaizeCropScience,CollaborativeInnovationCenterofHenanGrainCrops,CollegeofAgronomy,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 2.Seed Administrative Station of Henan, Zhengzhou 450016, China

ERFsaredownstreamcomponentinethylenesignalingandinvolvesinplantresponsestoethylene.Inthisstudy,anERFgene,designatedasZmERF1,wasisolatedfrom20DAPendospermofinbredDan232 (Zea maysL.)anditssequenceandexpressioncharacteristicswereanalyzed.ZmERF1contains811bpwitha690bpORF,andencodes230aawithasingleconservedAP2domain.Onlineproteinstructurepredictionrevealedthattherearethreeβ-sheetsandoneα-helixintheAP2domain.TheZmERF1localizedinthenucleusbyonlineproteinprediction. ZmERF1wascloselyhomologouswithsorghumSbERFandriceOsERF.ProkaryoticexpressionandWesternBlotanalysisshowedthatZmERF1proteinscouldbeobtainedinvitro.TheexpressionlevelofZmERF1proteinsinearly-stagewaslowerthanthatinlater-stageofendosperm(36DAP)inDan232. ZmERF1mayplayakeyroleinlater-stageofendospermdevelopmentinmaize.TheresultsofthisworkuncoveredcharacteristicsofERFsinmaize,andprovidedabasicforexploringtheirbiologicalfunctionsingrainsdevelopment.

AP2/EREBP family;ZmERF1; qPCR; Western Blot

2016-09-06; 接受日期：2016-12-15

國家自然科學(xué)基金項目(31671770)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(15A210003)資助。

史慶玲，農(nóng)藝師，研究方向為玉米分子生物學(xué)。E-mail：qinglingshi021@163.com。*通信作者：董永彬，副教授，研究方向為玉米遺傳育種。E-mail：dyb0816@163.com;李玉玲，教授，研究方向為玉米遺傳育種。E-mail：yuling_li@126.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.07