侯林濤 王騰岳 薦紅舉 王 嘉 李加納 劉列釗

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甘藍型油菜鹽脅迫下幼苗鮮重和干重QTL定位及候選基因分析

侯林濤**王騰岳**薦紅舉 王 嘉 李加納 劉列釗*

西南大學農學與生物科技學院, 重慶400715

鹽脅迫是非生物脅迫中影響作物產量的一個主要因素, 利用分子標記方法選育油菜耐鹽品種對提高油菜產量具有重要意義。選用來自GH06與P174雜交后通過單粒傳法連續(xù)自交獲得的高世代重組自交系群體, 以含16 g L–1NaCl的Hoagland溶液培養(yǎng)幼苗進行鹽脅迫處理25 d后, 分別測定葉和根的鮮重及干重, 根據(jù)已構建的高密度SNP遺傳連鎖圖譜進行QTL定位, 在QTL物理區(qū)間篩選耐鹽相關基因并以極端表型材料進行qRT-PCR分析。采用復合區(qū)間作圖法(CIM), 在對照和鹽脅迫處理中共檢測到19個QTL, 其中與鹽脅迫相關的有6個, 可解釋的表型變異7.16%~16.15%, 分布在A02、A04和C03染色體上, 將QTL置信區(qū)間序列和擬南芥中與鹽脅迫相關的基因比對分析, 共找到8個候選基因。對其中4個候選基因在極端表型材料中的表達分析表明,與基因在鹽脅迫處理后的48 h或72 h表達量均高于對照組, 即基因的表達由鹽脅迫引起, 而在敏感型材料中的相對表達量高于在耐鹽型材料中,在敏感型材料中沒有明顯變化, 但在耐鹽型材料中呈現(xiàn)先升高后降低的表達特征, 其表達可能會增強植株對鹽脅迫的耐受力。本研究為油菜耐鹽基因功能挖掘和油菜耐鹽品種選育奠定基礎。

甘藍型油菜; 鹽脅迫; 數(shù)量性狀位點; 單核苷酸多態(tài)性; 候選基因

土壤鹽漬化是危害農業(yè)生產的主要因素之一, 中國鹽漬土面積大、分布廣、類型多, 總面積達9913萬公頃, 約占國土面積的1.03%[1]。土壤中過量的鹽分會引起土壤物理和化學性質的改變, 導致農作物生長環(huán)境的惡化[2]。在我國, 油菜是繼水稻、玉米、小麥、大豆之后的第五大作物, 也是第一大油料作物, 常年種植面積約670萬公頃, 總產超過1100萬噸, 年產菜籽油約450萬噸, 占自產植物油總量的40%以上, 占草本植物油總量的57%以上[3]。甘藍型油菜在三大栽培類型油菜中種植面積最大, 被認為是比較耐鹽的作物之一[4]。因此我們期望通過甘藍型油菜耐鹽性定位研究為其耐鹽性和品種選育提供研究基礎, 進而實現(xiàn)鹽堿地的農業(yè)高效利用, 這對我國耕地農業(yè)生產能力的提升, 耕地數(shù)量的增加, 國家糧食安全的保障具有重要意義[5]。

隨著對油菜研究的不斷深入及SNP芯片和重測序的普及, 利用SNP分子標記技術建立高密度的遺傳圖譜, 對油菜重要性狀的QTL分析已經成為新常態(tài), 并且已經定位了與油菜含油量、千粒重、株高、產量等相關的QTL[6-10], 對于油菜在鹽脅迫條件下的研究大多集中在生理反應的測定[11-13], 而疏于對油菜耐鹽性狀基因的定位。Li等[14]利用甘藍型油菜DH系群體在正常和干旱脅迫條件下的5個指標(株高、根長、葉干重、根干重和總重)數(shù)據(jù)的QTL分析, 分別檢測到28個和31個QTL, 其中在正常環(huán)境下, 以油菜幼苗干重為指標檢測到18個QTL, 單個位點可解釋的表型變異為6.43%~18.97%; 旱脅迫環(huán)境下, 檢測到與幼苗干重相關的20個QTL, 單個位點可解釋的表型變異為5.87%~15.97%。薦紅舉等[15]利用本研究的RIL群體對鹽脅迫下種子發(fā)芽率的QTL分析, 檢測到11個相應的QTL, 位于A03和A09染色體上, 可解釋的表型變異為4.9%~10.9%。Moursi[16]利用DH群體在正常和鹽脅迫環(huán)境下的干重和鮮重數(shù)據(jù)進行QTL分析, 正常環(huán)境下找到4個QTL, 分別位于A06、A05、C02和C03染色體上, 貢獻率為36%; 鹽脅迫環(huán)境下找到3個QTL, 分別位于C03和C06染色體上, 共同可解釋的遺傳變異25%。

本試驗利用已經構建的高密度SNP遺傳連鎖圖譜對鹽脅迫環(huán)境下RIL群體葉和根的鮮重和干重進行QTL定位, 進而篩選出與鹽脅迫相關的候選基因并分析其在極端表型材料中的表達量, 為油菜耐鹽基因的進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以母本GH06與父本P174雜交, 采用單粒傳法連續(xù)自交10代, 構建高世代重組自交系群體(recombinant inbred line, RIL), 之后隨機選取其中的172個重組自交系進行SNP標記分析, 構建高密度SNP遺傳連鎖圖譜[17]。

1.2 鹽脅迫處理

挑選健康飽滿、大小均一的油菜種子, 置鋪2層定性濾紙的9 cm培養(yǎng)皿內, 每皿20粒, 加入適量的1/4 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)7~8 d。待種子發(fā)芽長成幼苗時, 從每株系各取生長健康一致的1植株, 3個重復, 分別置裝有質量濃度為0 g L–1和16 g L–1NaCl溶液[15](以Hoagland營養(yǎng)液為母液配制)的塑料盆中, 于溫室培養(yǎng)25 d, 設定溫度25℃, 光照16 h, 黑暗8 h。

1.3 幼苗鮮重、干重測定

用濾紙吸干每株系3個植株水分后分別用電子天平測量幼苗的葉鮮重、根鮮重, 取平均值。將幼苗放入105℃烘箱殺青30 min, 70℃烘箱烘干48 h至恒重, 然后用電子天平稱量幼苗的葉干重、根干重, 取平均值。

1.4 圖譜構建及QTL分析

所用SNP分子標記構建的遺傳連鎖圖譜[17], 包含2795個SNP多態(tài)性標記位點, 總長1832.9 cM, 相鄰標記間平均距離為0.66 cM。采用QTL分析軟件Windows QTL Cartographer 2.5[18]及復合區(qū)間作圖(composite interval mapping, CIM)法對RIL群體幼苗的葉鮮重、根鮮重與葉干重、根干重進行QTL定位及效應檢測[19]。CIM分析時, 選取1 cM的步長(walking speed), 按照假定檢測10和Zmapqtl模型3, 選取參數(shù)1000次回歸, 顯著水平為0.01。LOD≥3時, 即認為該區(qū)間可能存在一個QTL。運行軟件同時給出性狀QTL的加性效應和解釋的表型變異。按照McCouch等[20]的方法命名檢測到的QTL, 以“q”加相對應的性狀再加染色體編號表示, 字體為斜體。

1.5 候選基因的篩選

將檢測到的QTL的置信區(qū)間在甘藍型油菜基因組[21]上查詢到對應的序列, 然后與擬南芥基因組序列進行BlastN, E值設定為E–20, 最后篩選出每個QTL置信區(qū)間內匹配E值小于閾值的鹽脅迫相關基因, 共篩選出8個與鹽脅迫相關的基因。

1.6 RNA提取

根據(jù)RIL群體葉、根鮮重在鹽脅迫環(huán)境與正常環(huán)境下的比值, 篩選出對鹽敏感型材料(F215的比值分別為0.78和0.42, F328分別為0.76和0.37)和耐鹽型(F285的比值為分別1.02和1.50, F293分別為1.00和1.38)的極端表型材料, 在鹽脅迫處理24、48、72和96 h后取葉片, 將樣品迅速于–80℃保存。按照EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(RN09)說明提取樣品的總RNA。采用Bio-Rad iScript cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄, 反轉錄體系為5×iScript reaction mix 4mL, iScript reverse transcriptase 1mL, RNA模板(1mg) 1~3mL, ddH2O補充體積至20mL。反應條件為25℃ 5 min, 42℃ 30 min, 85℃ 5 min, 4℃保存。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

在甘藍型油菜基因組[21]中查找到候選基因的cDNA序列, 利用軟件Primer Premier 5.0設計特異引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。按照Bio-Rad公司的SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix 試劑盒使用說明在Bio-Rad CFX96上運行實時熒光定量PCR。反應體系為SsoAdvanced universal SYBR Green supermix (2×) 10mL, 正向引物0.4mL, 反向引物0.4mL, cDNA 2mL, ddH2O補充體積至20mL。反應初始變性溫度和時間為95℃/30 s, 然后95℃/10 s, 退火時間為30 s, 溫度因引物而異, 40個循環(huán)。熔解曲線為65~95℃之間以0.5℃遞增, 5 s。所有反應3個重復。用2–ΔΔCT方法以內參(油菜基因-)為標準計算每個基因的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

利用SPSS 17.0軟件完成相關性分析。利用MapChart 2.2作圖軟件分析染色體和QTL之間的遺傳距離, 在Microsoft Excel 2003和WPS 2016中處理其他數(shù)據(jù)。

表1 熒光定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 油菜幼苗在鹽脅迫條件下鮮重及干重的變化

RIL群體的鮮重、干重, 各數(shù)值均呈連續(xù)分布和雙向超親分離(表2、圖1和圖2), 表明這些性狀均為多基因控制的數(shù)量性狀, 其偏斜度和峰值均小1, 適合于QTL分析。除了鹽脅迫處理下根干重均值高于對照組外, 其余葉、根的鮮重、干重均值均低于對照組, 這表明鹽脅迫環(huán)境對幼苗的生長和發(fā)育產生了影響, 而根干重高于對照組可能由于幼苗在鹽脅迫環(huán)境下促進根系的生長。鹽脅迫下的葉鮮重均值要遠遠低于對照組, 而葉干重卻相差不大, 可能是由于鹽脅迫條件下離子濃度過高而影響植株的水分吸收。

2.2 油菜幼苗在2種環(huán)境下鮮重、干重的相關性分析

從表3可以看出2種處理下的葉干重顯著正相關, 相關系數(shù)為0.205。鹽脅迫環(huán)境下葉干重和根干重極顯著正相關, 相關系數(shù)為0.771, 鹽脅迫環(huán)境下葉鮮重和根鮮重極顯著相關, 相關系數(shù)為0.380。相關性分析表明, 相同的處理下, 相同部位干重和鮮重均極顯著相關。在對照和處理間, 只有葉片的干重和鮮重表現(xiàn)顯著和極顯著相關, 相關系數(shù)分別為0.205和0.246, 而根部在對照和處理間相關性不顯著。

2.3 正常環(huán)境下油菜幼苗干重、鮮重的QTL分析

總共檢測到13個QTL (表4和圖3)。油菜葉和根干重相關的QTL有4個, 分布在染色體A01、A10和C08上, 單個QTL可解釋的表型變異為8.43%~ 12.19%。其中C08染色體上的貢獻率為12.19%, LOD值為6.28。油菜幼苗葉和根鮮重的QTL有9個, 單個QTL可解釋的表型變異為7.08%~ 15.08%, 分布在A01、A08、A10和C08染色體上。其中分布在C08染色體上的QTL有4個, 貢獻率為7.56%~15.08%, 置信區(qū)間有部分重疊。檢測到A08染色體上3個QTL, 貢獻率為8.00%~8.84%, 置信區(qū)間相互靠近。在A01染色體上的QTL和置信區(qū)間完全重合, 推測在此區(qū)間內可能有控制這一性狀的基因。

表2 油菜幼苗在鹽脅迫處理和對照處理下干重、鮮重的分布特征

表3 油菜幼苗鹽脅迫處理和對照干重、鮮重的相關系數(shù)

**和*分別代表在0.01和0.05顯著水平。

**and*denote significant correlation at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

表4 利用復合區(qū)間作圖法檢測油菜幼苗干重、鮮重在正常環(huán)境下的QTL

2.4 鹽脅迫環(huán)境下油菜幼苗干重、鮮重的QTL定位

檢測到與鹽脅迫相關的QTL 6個(表5和圖4), 閾值為3.21~4.59, 單個QTL可解釋的表型變異為7.16%~16.15%, 分布在染色體A02、A04和C03上。分布在A02染色體上的QTL有3個, 單個QTL可解釋的表型變異為7.16%~11.75%。A04染色體上1個QTL, LOD值為4.66, 貢獻率為11.60%, 置信區(qū)間為58.00~77.40。C03染色體上2個QTL, 為和, LOD值分別為4.47和4.59, 共同可解釋的表型變異是31.75%, 置信區(qū)間有部分重疊。

2.5 候選基因篩選

在鹽脅迫環(huán)境下共檢測到6個QTL, 但由于和在甘藍型油菜基因組中沒有找到相應的序列, 故只能將4個QTL置信區(qū)間序列與擬南芥中鹽脅迫相關基因比對, 共檢測到8個候選基因(表6和表7)。其中在區(qū)間內1個, 匹配E值為E-137。區(qū)間內3個, 匹配E值介于0~2E-52之間。區(qū)間內只1個, 匹配E值為5E-25。區(qū)間內3個, 匹配E值為4E-35~E-167。

表5 利用復合區(qū)間作圖法檢測到油菜幼苗干重、鮮重在鹽脅迫環(huán)境下的QTL

表6 甘藍型油菜基因組中QTL置信區(qū)間候選基因與擬南芥鹽脅迫相關基因的比對

2.6 候選基因在2種環(huán)境下的表達水平

由圖4可知, 在敏感型材料中,基因鹽處理后的48 h或72 h表達量較高, 之后96 h表達量降低; 而在耐鹽型材料中,基因在鹽處理后的表達量先升高后降低之后在96 h又升高?；蚺c基因的表達水平特征相似。而基因在敏感型材料中鹽處理后的表達水平都有急劇升高的時期, 之后下降; 而其在耐鹽型材料中的表達量則沒有明顯變化?；騽t在敏感型材料中沒有明顯變化, 在耐鹽型材料中呈現(xiàn)先升高后降低的表達特征。

3 討論

作物生長會受到多種因素的影響, 包括生物脅迫和非生物脅迫, 非生物脅迫中鹽脅迫成為限制作物產量的一個重要因素[30]。油菜的營養(yǎng)價值和經濟價值極高, 已經成為植物油的主要來源, 然而其生長、產量和出油量會因為土壤鹽漬化而有所降低, 特別是油菜種子發(fā)芽和幼苗早期的生長發(fā)育更容易受到鹽害的影響[31]。從油菜幼苗在正常環(huán)境下和鹽脅迫環(huán)境下鮮重和干重的分布特征可以看出, 鹽脅迫下葉鮮重、干重的分布范圍較窄, 均值也低于對照組, 尤其是葉鮮重, 鹽脅迫環(huán)境下的葉鮮重均值幾乎為對照組的一半, 根干重和鮮重則變化不大。推測可能是由于外界環(huán)境鹽濃度高而影響了幼苗對水分的吸收, 從而導致植株葉鮮重有所下降, 這一結果與Tun?türk等[32]的研究結果一致。

植物對鹽脅迫的響應是一個復雜的生理過程[33-34], 它會引起很多相關性狀的改變, 如種子發(fā)芽率、植株鮮重干重等。我們采用SNP高密度遺傳連鎖圖譜對正常環(huán)境和鹽脅迫環(huán)境下的幼苗重量QTL分析, 發(fā)現(xiàn)兩種環(huán)境下檢測到的QTL有很大差異, 且分布的染色體也不同, 可能是由于油菜幼苗在不同處理下差異基因適應環(huán)境而產生不同的響應。鹽脅迫環(huán)境下共檢測到6個QTL, 其中分布在染色體A02上的有3個, 置信區(qū)間十分靠近且有部分重疊, A04染色體上有1個, 加性效應均來自于父本P174; C03染色體上有2個,與共同可解釋的表型變異為31.75%, 是鹽脅迫環(huán)境下找到的貢獻率最高的兩個QTL, 而在正常環(huán)境下并沒有檢測到, 因此推測它們可能是與鹽脅迫環(huán)境下幼苗根鮮重相關的主效QTL, 加性效應來自于母本GH06。Moursi[16]利用DH群體對正常和鹽脅迫環(huán)境下干重和鮮重得到的數(shù)據(jù)進行QTL分析, 鹽脅迫環(huán)境下找到3個QTL, 共同可解釋的遺傳變異為25%, 分別位于C03和C06染色體上, 但與和位置相距較遠。薦紅舉等[15]利用本研究的RIL群體對鹽脅迫下種子發(fā)芽率進行QTL分析,檢測到11個相應的QTL, 可解釋的表型變異為4.9%~10.9%, 位于A03和A09染色體上, 與我們檢測到的QTL所在染色體不一致, 推測可能是由于油菜在鹽脅迫環(huán)境下種子發(fā)芽和植株生長響應機制不同。

表7 篩選的在擬南芥中鹽脅迫相關候選基因功能

QTL的染色體上僅展示了QTL區(qū)段的標記及染色體兩端各2個標記。 Showing the markers in the QTL confidence intervals, along with the terminal two markers at each end of the QTL containing chromosomes.

本研究將鹽脅迫環(huán)境下檢測到的4個QTL置信區(qū)間與擬南芥鹽脅迫相關基因比對, 在每個區(qū)間內都找到了相應的候選基因, 共8個, 并對其中4個進行實時熒光定量PCR分析。研究結果表明,基因在擬南芥中對應基因的表達是由脫落酸、脫水、高鹽和低溫引起的, 本實驗中該基因在鹽脅迫環(huán)境下的表達量明顯高于對照組, 與Hong等[23]的研究結果一致。Osakabe等[35]在實驗中也發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過量表達基因會增強對鹽脅迫的耐受力。但Shi等[36]認為基因的過量表達會使擬南芥對鹽脅迫的耐受力降低, 當基因的表達量被限制時, 擬南芥對鹽脅迫的耐受力明顯升高。基因在擬南芥中對應基因的表達也是由脫落酸和鹽脅迫引起的, 在敏感型和耐鹽型材料中的表達特征與基因相似, 在耐鹽型材料中兩個基因在鹽處理后96 h表達量明顯升高(圖4), 推測可能是由于基因在耐鹽型材料中的表達量較高而使其對鹽脅迫環(huán)境的耐受力增強?；蛟跀M南芥中對應基因功能為編碼的蛋白質在體外培養(yǎng)具有先天性磷酸酶活性, 突變體對脫落酸, 低溫和氯化鈉十分敏感[26], 其在敏感型材料中的表達量在48 h或72 h高于耐鹽型材料(圖4), 可能是由于其對鹽脅迫環(huán)境更為敏感而高量表達以響應鹽脅迫。基因在擬南芥中對應基因功能為編碼一個纖維素合酶家族的成員, 其參與次生細胞壁的生物合成[28], 與對照組相比, 該基因在耐鹽型材料中的鹽處理后的表達量在48 h明顯升高(圖4), 之后降低, 推測是由于受到鹽脅迫環(huán)境影響而高量表達以增強對鹽脅迫環(huán)境的耐受力, 而敏感性材料則沒有, 所以對逆境的耐受力較差。Long等[37]通過RNA測序和PCR熒光定量方法在油菜中找到31個與鹽脅迫相關的基因, 但與我們發(fā)現(xiàn)的基因位點不一致, 推測可能是由于取材時間和部位不同, 由基因表達的時間和組織特異性引起的。

4 結論

鹽脅迫環(huán)境下油菜幼苗的鮮重和干重均低于對照組, 表明鹽脅迫對油菜生長有一定的影響。在染色體A02、A04和C03定位了6個鹽脅迫環(huán)境下油菜幼苗干重鮮重的QTL, 貢獻率超過10%的QTL有4個, 表明油菜耐鹽性是由多個微效基因調控的數(shù)量性狀。共找到8個候選基因, 對其中4個基因在極端表型材料中的qRT-PCR分析表明,和基因的表達由鹽脅迫引起,基因相對高量表達可能會增強植株對鹽脅迫環(huán)境的耐受力。今后的研究應對篩選出的候選基因進行功能驗證等深入分析, 為耐鹽基因定位和鹽脅迫相關機制的研究提供理論依據(jù)。

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QTL Mapping for Seedling Dry Weight and Fresh Weight under Salt Stress and Candidate Genes Analysis inL.

HOU Lin-Tao**, WANG Teng-Yue**, JIAN Hong-Ju, WANG Jia, LI Jia-Na, and LIU Lie-Zhao*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Salt stress is one of the main abiotic stresses affecting crop yield and it would be very important by using the salt tole-rance related markers in rapeseed breeding to improve the oilseed production. In this research, theL. high generation recombinant inbred lines (RIL) population derived from the cross of GH06 and P174 via single seed descent propagation was used for QTL mapping and candidate gene analysis. The fresh and dry weight of leaf and root were measured at 25 days after the seedlings were grown in Hoagland solution with 16 g L–1NaCl. Composite interval mapping (CIM) was used to identify the related QTLs according to the high density SNP genetic map, and the candidate gene expression in the extreme lines tested by qRT-PCR. A total of 19 QTLs were identified in the control and salt stress treatment, and six QTLs were mapped on chromosomes A02, A04, and C03 under salt stress, with contribution rate ranged from 7.16% to 16.15%. Eight genes were identified according to the BLAST of genes in the QTL confidence intervals and the salt stress related genes in. The expression of four candidate genes in the extreme lines showed thatandunder salt stress treatment for 48 or 72 hours had higher expression than the control, which indicates that the expressions are induced by salt stress. The relative expressions of genein sensitive extreme lines were higher than those in tolerant extreme lines. There were no changed in expression for genein sensitive extreme lines but increased expression at 48 hours and reduced expression at 72 hours after salt treatment in tolerant extreme lines, showing the enhance of plant salt tolerance possibly. Our research laid a foundation for the function research of salt tolerant gene in rapeseed and the breeding of salt tolerant rapeseed.

L; Salt stress; QTL; SNP; Candidate gene

本研究由國家自然科學基金項目(31371655)資助。

The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31371655).

2016-04-20; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(網絡出版日期)： 2016-09-27.

10.3724/SP.J.1006.2017.00179

劉列釗, E-mail: liezhao2003@126.com, Tel: 023-68250701**同等貢獻(Contributed equally to this work)

E-mail: 594632283@qq.com

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160927.0842.002.html