付必勝 劉 穎 張巧鳳 吳小有 高海東 蔡士賓 戴廷波 吳紀(jì)中,*

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與小麥抗白粉病基因緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)

付必勝1,**劉 穎1,2,**張巧鳳1吳小有1高海東3蔡士賓1戴廷波2,*吳紀(jì)中1,*

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/ 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺, 江蘇南京210014;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 江蘇南京210095;3南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司, 江蘇南京210014

為本實驗室鑒定的一個抗白粉病新基因。為精細(xì)定位該基因, 利用混池ddRAD測序鑒定了81個與該基因關(guān)聯(lián)的序列, 開發(fā)了STS標(biāo)記, 轉(zhuǎn)化了CAPS標(biāo)記、和; 同時, 利用粗山羊草基因組序列開發(fā)了71個基因組SSR標(biāo)記, 定位了其中的和。在115個寧糯麥1號′Tabasco衍生的 F2:3家系中,與目的基因共分離,位于近著絲粒方向處距抗病基因3.1 cM。在671個純合感病家系中, 標(biāo)記仍與目的基因共分離。利用3個中國春5DS缺失系, 最終將定位在小麥5DS上0.63–0.67的臂區(qū)段中。

小麥; 抗白粉病基因; 分子標(biāo)記; 混池ddRAD測序

由禾布氏白粉病菌(f. sp.)引起的白粉病是小麥的重要病害, 在嚴(yán)重流行年份可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)34%以上[1]。抗病品種在小麥白粉病防治中發(fā)揮了重要作用, 但白粉病菌的變異會導(dǎo)致抗病品種喪失抗性, 因此需要不斷挖掘新的抗病基因來培育小麥抗白粉病新品種。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展, 分子標(biāo)記的類型逐漸豐富, 如初期的RFLP (restriction fragment length polymorphism)、AFLP (amplified fragment length polymorphism), 以及根據(jù)序列開發(fā)的SSR (simple sequence repeats)、STS (sequence tagged sites)、CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)、dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic sequence)、SNP (single nucleotide-acid polymorphism)等。分子標(biāo)記類型的豐富以及越來越成熟的分子標(biāo)記技術(shù)極大地推動了小麥抗白粉病新基因的發(fā)掘, 越來越多的小麥抗白粉病基因通過分子標(biāo)記技術(shù)得到鑒定, 如[2]、[3]、[4]等。迄今為止, 已經(jīng)在50個位點報道了80多個抗白粉病基因[5], 分布在小麥除4D和5A以外的所有染色體上。

由于小麥還沒有完整的基因組序列, 在特定染色體區(qū)域開發(fā)標(biāo)記一般需要借助物理定位的EST、共線性關(guān)系、基因組序列、SNP芯片序列信息開發(fā)標(biāo)記。在小麥中, 不同倍性小麥的遺傳和物理圖譜信息、網(wǎng)上公布的水稻、短柄草、大量小麥EST序列信息和小麥基因組序列信息等是用于飽和目標(biāo)基因區(qū)域遺傳圖譜的重要標(biāo)記來源。這些信息為開發(fā)新的標(biāo)記奠定了良好的基礎(chǔ)。

近年蓬勃發(fā)展的高通量測序也是基因型分析的一種新策略。為了降低復(fù)雜基因組的測序費用, 研究者已經(jīng)提出了基于第二代測序技術(shù)的簡化代表文庫測序策略[6], 其中最簡單的方法是分離純化特定片段大小范圍的限制性酶切片段。如, 利用RAD (restriction site-associated DNA, 限制性酶切位點關(guān)聯(lián)DNA)測序方法已成功構(gòu)建了若干高密度遺傳圖譜[7-8]。而ddRAD (double-digest RAD, 雙酶切RAD)測序是RAD衍生的一種測序策略[9], 與RAD的單末端測序相比, ddRAD的雙末端測序能夠增加標(biāo)記的特異性和準(zhǔn)確性。近年, 在花生[10]、草莓[11]、油菜[12]等物種中已經(jīng)利用該測序方法構(gòu)建了若干高密度遺傳圖譜。

目前, 已經(jīng)克隆的小麥抗病基因有[13]、[14]、[15]和//[16]等, 而抗白粉病基因只克隆了[17]和[18]。本實驗室在德國小麥品種Tabasco中鑒定到抗白粉病基因, 位于5DS染色體上[19], 后由于基因重名被重新命名為[20]。本實驗室鑒定了與緊密連鎖的分子標(biāo)記, 但只包括1個顯性STS標(biāo)記和5個SSR標(biāo)記[19]。顯性標(biāo)記在分離群體中的帶型信息相對較少, 不利于該基因的有效利用; 另外, SSR標(biāo)記由于是基于重復(fù)序列的標(biāo)記類型, 沒有足夠的序列信息, 不利于抗病基因的比較基因組學(xué)分析及進(jìn)一步精細(xì)定位。因此, 本實驗室深入研究并開發(fā)了與緊密連鎖的新類型分子標(biāo)記, 為該基因的分離和有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用抗小麥白粉病的德國品種Tabasco與本實驗室培育的糯性感病品種糯麥1號, 經(jīng)雜交和自交獲得4129個寧糯麥1號×Tabasco F2單株, 用于抗性遺傳分析; 從436個F2:3家系[19]中隨機選擇115個家系組成分離群體用于新開發(fā)分子標(biāo)記的多態(tài)性分析和定位。

利用“中國春”及其缺失系del5DS-1、del5DS-2和del5DS-5進(jìn)行目標(biāo)分子標(biāo)記的染色體臂定位, 其中del5DS-1保留有5DS末端63%長度, 缺失了37%的染色體長度, del5DS-5保留有染色體5DS末端67%長度, 缺失了33%的染色體長度, del5DS-2保留有5DS末端78%長度, 缺失了22%的染色體長度[21]。

1.2 抗病性評價方法

參考高海東等[19]報道的方法評價白粉病抗性。將小麥種子播在72孔的穴盤, 親本品種及家系各播種15~20粒, 每穴盤隨機種植9粒感病對照蘇麥3號。于幼苗一葉期人工接種, 將充分發(fā)病的足量蘇麥3號葉片懸于待接葉片上方, 輕輕抖落病菌孢子, 菌種為南京地區(qū)流行的Bgt18。在人工智能氣候室(14 h光照/10 h黑暗, 18~22℃, 相對濕度80%~90%)中培養(yǎng)接種后的麥苗。接種后7 d當(dāng)感病對照表現(xiàn)出明顯病癥時調(diào)查病情, 按盛寶欽[22]的0~4級分類方法記錄, 即0級為免疫, 植株無病斑, 0;級為壞死反應(yīng), 葉片有枯死斑, 1級為高抗, 病斑直徑小于l mm, 菌絲層稀薄可見綠色葉面, 偶見較大病斑, 但仍透綠, 產(chǎn)孢量極少, 2級為中抗, 葉片病斑直徑小于l mm, 但菌絲層較厚, 不透綠, 能產(chǎn)生一定量孢子, 3級為中感, 葉片病斑多, 且直徑大于l mm, 菌絲層厚, 產(chǎn)孢量大, 但病斑不連片, 4級為高感, 葉片病斑直徑大于l mm, 菌絲層厚, 產(chǎn)孢量多, 病斑連片。

1.3 分子標(biāo)記開發(fā)

1.3.1 基于ddRAD測序獲得的序列 根據(jù)前期F2:3家系的分子鑒定結(jié)果[19], 從中隨機選取50個純合抗病家系和50個純合感病家系, 每家系選取8株, 將其DNA等量混合構(gòu)建抗池(BR)和感池(BS), 由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行ddRAD測序。根據(jù)抗感池序列SNP是否產(chǎn)生酶切位點差異, 決定轉(zhuǎn)化成CAPS或dCAPS標(biāo)記。如果抗、感池間的SNP存在酶切位點的差異, 則直接將該SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成CAPS標(biāo)記, 即在SNP位點兩側(cè)設(shè)計引物, 并利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切; 如果抗、感池間的SNP不存在酶切位點的差異, 則利用軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和Primer 5.0將SNP轉(zhuǎn)化成dCAPS標(biāo)記, 即在引物中引入錯配與SNP位點形成新的酶切位點。新開發(fā)的多態(tài)標(biāo)記信息見表1。

1.3.2 基于粗山羊草基因組序列 高海東等[19]鑒定出的緊密連鎖標(biāo)記。本研究利用序列及ddRAD測序獲得的多態(tài)標(biāo)記序列, 在線搜索比對粗山羊草標(biāo)記序列(http://probes.pw.usda.gov/WheatDMarker/ phpblast/blast.php)。先對相應(yīng)的粗山羊草基因組序列進(jìn)行SSR篩查, 然后用MACVECTOR V8.0 (Accelrys, UK)設(shè)計引物, 并進(jìn)行親本及抗感池間多態(tài)性篩選。新開發(fā)的多態(tài)標(biāo)記信息見表1。

表1 基于ddRAD測序和粗山羊草基因組序列新開發(fā)的標(biāo)記信息

1.4 分子標(biāo)記分析

參照Ma等[23]報道的SDS法, 從小麥嫩葉中提取總DNA, –4℃保存。在SENSOQUEST LABCYCLER PCR儀(德國)上擴增, 反應(yīng)體系為10 μL, 包括1×buffer 10 μL (含MgCl215 nmol), DNA模板1 ng, 上、下游引物各2 pmol, 2 nmol的dNTPs, 1 U酶。PCR程序為94℃預(yù)變性5 min, 然后按94℃變性30 s、50~60℃退火45 s、72℃延伸50 s進(jìn)行36個循環(huán)擴增, 最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 銀染法顯色。

CAPS標(biāo)記選擇特定的限制性內(nèi)切酶(TaKaRa), 如I、I、II、188I和I, 按生產(chǎn)商說明書進(jìn)行酶切反應(yīng), 反應(yīng)體系8 μL, 含PCR產(chǎn)物約50 ng, 于37°C或65°C (依酶特性而定)過夜, 用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測酶切產(chǎn)物。

1.5 遺傳圖譜構(gòu)建

采用MapMaker 3.0b/EXP[24]和MapDraw V2.1[25]構(gòu)建連鎖圖譜, 選用Kosambi函數(shù)[26]計算遺傳距離, 連鎖判斷LOD閾值設(shè)為3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 與連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)及定位

對抗池、感池進(jìn)行ddRAD測序, 獲得81個可能與關(guān)聯(lián)的SNP序列, 將其中14個關(guān)聯(lián)性強的SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為STS或者CAPS標(biāo)記。其中,在抗、感親本間有多態(tài)性, 且與抗、感池表現(xiàn)一致;(圖1-A)、(圖1-B)和經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后, 在抗、感親本以及池間表現(xiàn)一致多態(tài)性。利用這4個新開發(fā)的標(biāo)記檢測115個F2:3家系, 結(jié)果4個標(biāo)記均被定位于的遺傳圖譜上, 其中與目標(biāo)基因共分離,、和位于遠(yuǎn)著絲粒的一側(cè), 與目標(biāo)基因分別相距7.8、9.7和15.7 cM (圖2-A)。

利用已定位連鎖標(biāo)記序列信息, 比對粗山羊草基因組序列, 開發(fā)了71個gSSR標(biāo)記, 其中(圖1-C)和(圖3)在抗、感基因型間存在多態(tài)性, 并且被整合到連鎖圖譜中, 距分別為3.1 cM和10.8 cM (圖2-A)。

M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: 寧糯麥1號; 3: 抗病池; 4: 感病池。

M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: Ningnuomai 1; 3: resistant pool; 4: susceptible pool.

2.2的染色體臂定位

利用3個中國春5DS缺失系對進(jìn)行染色體臂定位, 結(jié)果顯示位于小麥5DS 0.63~0.67的染色體區(qū)段(圖3), 在該染色體區(qū)段中已定位標(biāo)記[19], 同時連鎖圖譜顯示位于這2個標(biāo)記之間(圖2-A), 因此認(rèn)為位于小麥5DS 0.63~0.67的染色體區(qū)段(圖2-B)。

A圖中左側(cè)數(shù)字為遺傳距離(cM); B圖中右側(cè)括號內(nèi)數(shù)字是著絲粒到染色體斷點處長度與染色體短臂總長度的比值, 下方橢圓代表著絲粒。

In linkage map A, numbers on the left indicate genetic distances (cM). In physical map B, numbers in the parentheses indicate the ratio of length from centromere to chromosome breakpoint/total length of the short arm of chromosome and the ellipse at the bottom shows the position of centromere.

2.3 重組體的篩選

利用4129個F2單株, 通過接種Bgt18鑒定抗病性, 結(jié)果有3103個抗病單株和1026個感病單株, 符合單個顯性基因的3︰1分離(c2=0.04;c20.05,1=3.84)。這些感病單株移栽后完成整個生育期并收獲種子的有671個家系, 對每個家系衍生的15~20個植株進(jìn)行表型鑒定后, 推測均為純合感病家系。利用位于兩側(cè)的分子標(biāo)記對這671個純合感病家系進(jìn)行基因型檢測, 其中共顯性標(biāo)記和分別篩選到12個和8個重組家系; 標(biāo)記和對這19個重組體進(jìn)行基因型的分析結(jié)果表明,檢測到5個重組體,沒有檢測到重組體, 與目標(biāo)基因共分離(表2)。

M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: 寧糯麥1號; 3~5: 中國春缺體系del5DS-1、del5DS-2和del5DS-5; 6: 中國春。箭頭指示目標(biāo)帶缺失。

M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: Ningnuomai 1; 3–5: Chinese Spring deletion lines del5DS-1, del5DS-2 and del5DS-5; 6: Chinese Spring. The arrow shows vacancy of target band.

3 討論

為進(jìn)一步精細(xì)定位小麥抗白粉病基因, 本研究利用簡化測序和粗山羊草基因組序列信息開發(fā)了6個新標(biāo)記。與實驗室之前發(fā)表的遺傳圖譜[19]相比, 本研究在與基因之間新增了2個gSSR標(biāo)記(和), 將界定在和之間的4.6 cM之間, 為基因的進(jìn)一步分離奠定了基礎(chǔ)。此外, 還開發(fā)了一個與基因共分離的標(biāo)記, 該標(biāo)記無論在小群體中還是在擴大的純合感病家系中均與抗病基因共分離, 將作為抗病基因的重要選擇標(biāo)記。是重復(fù)序列連接(repeat junction)類型的標(biāo)記, 這類標(biāo)記在重復(fù)序列超過80%的小麥基因組中非常豐富[27], 將是小麥基因定位的重要標(biāo)記類型, 然而該類型標(biāo)記無法與基因序列關(guān)聯(lián), 很難為基因分離提供幫助。

表2 19個純合感病重組體基因型分析和分類

重組體I、III、IV只發(fā)生1次重組, 分別在–、–、–標(biāo)記區(qū)間; 重組體II發(fā)生2次重組, 分別在–和–標(biāo)記區(qū)間。A: Tabasco等位位點; B: 寧糯麥1號等位位點; A_: 顯性基因型, 包括Tabasco基因型和雜合基因型。

Only one recombination occurred in types I, III, and IV at the marker interval of–,–, and–, respectively; whereas twice recombinations occurred in type II at marker intervals of–and–. A: Tabasco allele; B: Ningnuomai 1 allele; A_: dominant genotype including Tabasco genotype and heterozygous genotype.

簡化測序可以降低測序成本, 根據(jù)性狀混池后測序更進(jìn)一步降低成本。本研究利用ddRAD測序成功開發(fā)了3個CAPS標(biāo)記和1個STS標(biāo)記, 轉(zhuǎn)化了與基因關(guān)聯(lián)性強的14個SNP標(biāo)記, 其中4個(28.6%)為多態(tài)性標(biāo)記, 而其余標(biāo)記沒有多態(tài)性。對于沒有轉(zhuǎn)化成功的10個SNP標(biāo)記, 推測是由于ddRAD測序后獲得的重復(fù)序列導(dǎo)致非特異性以及擴增引入的錯配。本研究還利用粗山羊草基因組序列開發(fā)了71個gSSR標(biāo)記, 但只有2個被定位, 多態(tài)率為2.8%, 遠(yuǎn)低于其他研究報道的gSSR的多態(tài)率[28-30]。推測可能的原因, 一是D基因組的多態(tài)性偏低[28-30], 二是Tabasco、寧糯麥1號兩親本的分子標(biāo)記多態(tài)率低。對比上述兩種方法, 利用混池的ddRAD測序效率較高。

本研究利用5DS缺失系成功將抗病基因定位在小麥5DS 0.63–0.67的染色體區(qū)段中, 這一區(qū)段的物理距離大約為55 Mb[31]。標(biāo)記和相距8.0 cM, 假定兩標(biāo)記位于邊界, 該區(qū)域的重組率估算為0.145 cM/Mb, 低于Erayman等[32]在該區(qū)域估算的重組率(0.341 cM/Mb), 并非重組熱點區(qū)域。盡管如此, 該區(qū)段較小的物理距離仍然將有助于抗病基因的分離。本實驗室將在以下兩方面進(jìn)一步研究, 一是解決標(biāo)記多態(tài)性低的問題, 準(zhǔn)備利用不同的感病親本與Tabasco構(gòu)建多個分離群體, 構(gòu)建的飽和遺傳圖譜; 二是利用混池進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序, 發(fā)掘候選基因。

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Development of Markers Closely Linked with Wheat Powdery Mildew Resistance Gene

FU Bi-Sheng1,**, LIU Ying1,2,**ZHANG Qiao-Feng1, WU Xiao-You1,GAO Hai-Dong3, CAI Shi-Bin1, DAI Ting-Bo2,*, and WU Ji-Zhong1,*

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China;2College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;3Genepioneer Biotechnologies Co. Ltd., Nanjing 210014, China

is a novel powdery mildew resistance gene identified previously in our laboratory. This study aimed at developing close molecular markers for fine mapping of the gene. The ddRAD-sequencing assay revealed 81 SNPs associated with the target gene, in which one converted into the STS markerand three converted into the CAPS markers,, and. We also developed 71 genomic SSR markers according to the genome sequence of. And mapped two of them,and. Using the 115 F2:3families derived from the cross of Ningnuomai 1′Tabasco,the target gene was found to be co-segregated withand distal towith the genetic distance of 3.1 cM towards centromere. In the 671 homozygous susceptible families,also showed co-segregated with the target gene. We also physically mappedto the bin of 5DS 0.63–0.67 by using three Chinese Spring 5DS deletion lines.

Wheat; Powdery mildew resistance gene; Molecular markers; Bulked ddRAD-seq

本研究由國家科技支撐計劃項目(2013BAD01B02-12), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-3-1-17), 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(14)5006)和江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012783)資助。

This study was supported by the National Key Technology R&D Program of China (2013BAD01B02-12), the China Agriculture Research System (CARS-3-1-17), Jiangsu Provincial Foundation of Agricultural Scienti?c Innovation [CX (14)5006], and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK2012783).

2016-07-26; Accepted(接受日期): 2016-11-02; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期)： 2016-11-15.

10.3724/SP.J.1006.2017.00307

吳紀(jì)中, E-mail: wujz@jaas.ac.cn, Tel: 025-84391667; 戴廷波, E-mail: tingbod@njau.edu.cn, Tel: 025-84395033

E-mail: fbs1006@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equality to this work)

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20161115.1618.002.html