戚 玲， 李佩云， 邢冬梅， 賈 帆

探討GABAARG2基因在癲癇耐藥機(jī)制中的作用

戚 玲， 李佩云， 邢冬梅， 賈 帆

目的 探討癲癇患者中GABAARG2基因與耐藥性癲癇的關(guān)系。方法 選擇來本院就診的98例癲癇患者，根據(jù)對(duì)抗癲癇藥物的反應(yīng)性分為耐藥組(觀察組)46例和敏感組(對(duì)照組)52例進(jìn)行研究，提取所有患者的DNA，采用PCR基因測(cè)序鑒定GABAARG2基因出現(xiàn)的概率，對(duì)每一位受試者以口服傳統(tǒng)的抗癲癇藥物-苯妥英(phenytoin)方式來對(duì)比兩組患者的藥物口服吸收率。結(jié)果 觀察組和對(duì)照組之間的年齡、性別、既往病史、持續(xù)狀態(tài)方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組出現(xiàn)GABAARG2基因的概率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.08，P=0.01)；觀察組的總體口服吸收率(68.71%±12.28%)明顯低于對(duì)照組的口服吸收率(82.36%±15.31%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.78，P=0.01)。結(jié)論 GABAARG2基因的在腦內(nèi)的出現(xiàn)會(huì)影響抗癲癇藥物的效果，進(jìn)而引起患者的耐藥性，對(duì)臨床治療有較好的參考價(jià)值。

GABAARG2基因； 苯妥英； 耐藥性癲癇； 多形性

癲癇(epilepsy)起因于腦部不正常放電而引起的抽筋、抽搐性神經(jīng)性癥狀(neurological disorders)，發(fā)病率約1%～2%。目前治療方式多以抗癲癇藥物(antiepilepticdrugs，AEDs)來舒緩癥狀的發(fā)作，大多數(shù)的病患能因此得到良好的癥狀控制，但約有30%的患者即使給予足夠量的藥物仍無法有效控制癲癇癥狀，而稱為耐藥性癲癇(drug resistant epilepsy)[1～3]。癲癇患者對(duì)抗癲癇藥物產(chǎn)生耐藥性(pharmacoresistance)的機(jī)制目前還不清楚，可能包含許多因素[4～6]：有可能是基因例如基因多型性造成的，可以解釋為何有相同癲癇癥狀的病患對(duì)同一種抗癲癇藥物卻有不同的反應(yīng)；也可能是治療的過程中，疾病本身的因素改變了藥物的目標(biāo)受體或藥物進(jìn)入腦部的含量；另外也可能是藥物的因素例如對(duì)藥物的容忍性(tolerance)上升使得藥效降低而無法有效控制癲癇癥狀。多數(shù)的耐藥性癲癇病患都具有1個(gè)重要特征，即不只會(huì)對(duì)一種而是對(duì)大部分甚至是所有的抗癲癇藥物皆會(huì)產(chǎn)生耐藥性，所以若第一種抗癲癇藥物無法有效控制癲癇癥狀，即使服用不同機(jī)制的抗癲癇藥物，也僅有約10%的機(jī)會(huì)能得到良好控制，此現(xiàn)象說明耐藥型癲癇所產(chǎn)生的耐藥性應(yīng)該不是通過藥物目標(biāo)受體的改變，而可能是血腦屏障的轉(zhuǎn)送器大量表現(xiàn)，進(jìn)而非專一性的降低所有進(jìn)入腦部的抗癲癇藥物含量。國外研究表明GABAARG2基因變異可能會(huì)導(dǎo)致用戶出現(xiàn)驚厥疊加全面性癲癇[7，8]，目前國內(nèi)尚未有GABAARG2基因多形性與耐藥性癲癇之間的關(guān)系的研究，本文針對(duì)昆明地區(qū)癲癇患者分析GABAARG2基因在癲癇耐藥機(jī)制中的作用，對(duì)臨床治療具有一定的參考價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

對(duì)來本院就診的癲癇患者進(jìn)行腦部影像掃描和腦電圖測(cè)量，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)昆明漢族人；(2)至少有兩次以上的癲癇發(fā)病史，且兩次間隔時(shí)間不低于2 h；(3)已經(jīng)正常服用藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無法確診癲癇類型；(2)后天大腦受損傷的有明確病因?qū)е碌陌d癇；(3)肝腎功能不全者；(4)不簽署知情同意書或無法溝通者。最終選擇98例患者作為研究對(duì)象，并根據(jù)對(duì)抗癲癇藥物的反應(yīng)性，分為耐藥組(觀察組)46例和敏感組(對(duì)照組)52例，觀察組患者平均年齡為(26.17±10.38)歲，對(duì)照組平均年齡為(25.78±11.37)歲，所有患者或家屬簽署知情同意書，本研究通過醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)的審核。

1.2 材料與方法

1.2.1 提取DNA 受試者抽取 10 ml 靜脈血后和heparin 混合均勻，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱做genomic DNA 制備。分析受試者的GABAARG2基因型，統(tǒng)計(jì)出該基因C588T多態(tài)位點(diǎn)在患者中的出現(xiàn)頻率。以Gentra基因組DNA純化試劑盒(Gentra Genomic DNA purification kit) 抽取genomic DNA，再以限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) (PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP) 鑒定GABAARG2基因型[9，10]。具體流程如下：

(1) DNA純化：使用Gentra基因組DNA純化試劑盒，300 ml全血加入900 μl 紅細(xì)胞消散溶液(RBC Lysis Solution)，顛倒混勻后，室溫15 min，13000 r/m 離心20 s。

(2) 除上清液，留下約 20～30 ml溶液，劇烈振蕩30 s，加300 ml 細(xì)胞裂解液(Cell Lysis Solution)，劇烈振蕩30 s，37 ℃過夜保存。

(3) 加1.5 ml核糖核酸酶A溶液(RNase A solusion)，顛倒混勻5～8次，放置15 min，加100 μl蛋白沉淀液(Protein Precipitation Solution)，劇烈振蕩30 s，13000 r/m離心3 min。

(4)取上清液，加 300 μl 100%異丙醇，輕輕混合至DNA 已完全析出，13000 r/m 離心1 min，除上清液加70%酒精顛倒漂洗1～3 min，13000 r/m 離心1 min。

(5)除上清液，倒置至乙醇完全揮發(fā)，加40 ml DNA Hydration Solution，室溫過夜回溶DNA以分光亮度計(jì)測(cè)量 OD260 定量。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 每一位受試者，都會(huì)以口服傳統(tǒng)抗癲癇藥物-苯妥英(phenytoin)的方式來觀察藥物在體內(nèi)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是希望同一位受試者口服phenytoin的血中濃度-時(shí)間曲線下面積值(area under concentration-time curve；AUC)與靜脈注射phenytoin的AUC值相同，每一位受試者皆口服phenytoin 300 mg。實(shí)驗(yàn)方法：每一位受試者在第一階段先口服單一劑量phenytoin 300 mg，在特定的抽血時(shí)間點(diǎn)收集靜脈血后，以HPLC求出血中濃度-時(shí)間曲線圖，同時(shí)求出此位受試者的口服吸收率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組研究對(duì)象一般資料及臨床資料比較

觀察組和對(duì)照組的患者資料比較見表1所示，兩組患者在年齡、性別、發(fā)作次數(shù)、持續(xù)狀態(tài)方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而觀察組GABAARG2基因出現(xiàn)概率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GABAARG2基因的二維圖以及對(duì)應(yīng)的PCR電泳圖如圖1和圖2所示。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料及臨床資料比較

2.2 各組患者對(duì)phenytoin的口服吸收率

由表2中可見，觀察組患者的phenytoin總體吸收率為68.71%±12.28，明顯小于對(duì)照組的吸收率82.36%±15.31%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外由表3可見，觀察組和對(duì)照組中出現(xiàn)GABAARG2基因的患者的phenytoin吸收率顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩組研究對(duì)象總體的口服吸收率(%)

表3 兩組研究對(duì)象的分類口服吸收率

圖1 GABAARG2基因的二維圖

圖2 GABAARG2基因PCR電泳圖

3 討 論

約有30%的癲癇病患對(duì)于各種抗癲癇藥物皆會(huì)產(chǎn)生耐藥性(pharmacoresistance)，與癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥產(chǎn)生抗藥性相似，進(jìn)而造成耐藥型癲癇。Tishler 在1995 年首先發(fā)現(xiàn)在對(duì)藥物具有抗性的癲癇病患腦部中有GABAARG2基因大量表現(xiàn)的情況，同時(shí)腦部的微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星狀細(xì)胞中GABAARG2基因的表現(xiàn)量上升，這可能限制AEDs 進(jìn)入腦部的含量，因此GABAARG2基因被認(rèn)為在耐藥型癲癇所產(chǎn)生的耐藥性中可能扮演了重要的角色[11]。沈江華等[12]在具耐藥性的癲癇病患腦部的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及星狀細(xì)胞發(fā)現(xiàn)GABAARG2基因有大量表現(xiàn)的情況，使得癲癇發(fā)作區(qū)的AEDs濃度下降進(jìn)而導(dǎo)致病患對(duì)AEDs 的治療產(chǎn)生耐藥性；而有研究顯示在血腦屏障(blood-brain-barriers，BBB)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞及癲癇病灶處過度表現(xiàn)的P糖蛋白可能是導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的重要原因，進(jìn)而造成耐藥型癲癇[13]。

GABAARG2基因具有功能性的單核苷酸多型性(SNPs，single nucleotide polymorphism)，這些SNPs可能改變GABAARG2的功能而影響其對(duì)AEDs的運(yùn)輸，故GABAARG2上的基因多型性在癲癇病患所產(chǎn)生的耐藥性中可能扮演了重要的角色；而GABAARG2具有功能性的SNPs 使其表現(xiàn)量上升與耐藥性產(chǎn)生的相關(guān)性則不僅局限在腦部，在小腸表現(xiàn)的GABAARG2基因可能扮演了藥物由腸腔進(jìn)入血液循環(huán)的屏障，進(jìn)而影響抗癲癇藥物的口服吸收率[14，15]。在耐藥型癲癇病患中發(fā)現(xiàn)GABAARG2基因表現(xiàn)量上升，即使持續(xù)給予抗癲癇藥物phenytoin 或phenobarbital，患者血液中的藥物濃度仍無法維持正常的治療劑量。因?yàn)镚ABAARG2基因在血腦屏障微血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表現(xiàn)可能會(huì)影響藥物在血腦屏障的通透性，故AEDs 如果是P糖蛋白的受質(zhì)，在臨床上將具有重要的意義[16]。

抗癲癇藥物 phenytoin是一重要且普遍使用的抗癲癇藥物，不過卻一直存在個(gè)體間的用藥差異性。Phenytoin 口服的生體可用率差異很大，是由首渡效應(yīng)的差異所造成。不同癲癇病患對(duì)同一種抗癲癇藥物反應(yīng)結(jié)果可能不一樣，目前推測(cè)可能與藥物基因體學(xué)有關(guān)[17，18]。耐藥型癲癇病患對(duì)各種不同機(jī)制的抗癲癇藥物都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，與癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生的多重抗藥性相似，而同時(shí)在耐藥型癲癇病患腦部也可以發(fā)現(xiàn)GABAARG2基因的表現(xiàn)量大量上升，此可能是疾病的重要成因，所以GABAARG2基因在耐藥型癲癇的藥物基因體學(xué)上被認(rèn)為可能扮演了重要的角色[19，20]。

本文對(duì)癲癇患者口服phenytoin，觀察在兩組患者GABAARG2基因表現(xiàn)對(duì)phenytoin藥物吸收的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組的總體吸收率為(68.71±12.28)%，而對(duì)照組的吸收率為(82.36±15.31)%，兩組患者的口服吸收率具有顯著差異(P<0.05)，另外觀察組和對(duì)照組中出現(xiàn)GABAARG2基因的患者的口服吸收率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，與先前的研究結(jié)果類似，故證實(shí)GABAARG2基因?qū)Πd癇患者口服phenytoin的吸收率有確切的影響，在耐藥型癲癇病形成上扮演了重要的角色。然而是否真的具有功能性的基因多型性位點(diǎn)而影響GABAARG2基因的表現(xiàn)量與功能，進(jìn)而影響臨床用藥的藥效或藥動(dòng)性質(zhì)仍需做進(jìn)一步的研究。

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Association study between the C588T polymorphism of GABAARG2 gene and drug-resistant epilepsy

QILing，LIPeiyun，XINGDongmei，etal.

(DepartmentofNeurology，thethirdpeople’sHospitalofYunnanProvince，Kunming650011，China)

Objective To investigate the relationship between GABAARG2 gene and drug-resistant epilepsy in patients with epilepsy. Methods According to the reactivity of the anti epileptic drugs，98 patients with epilepsy were divided into two groups：drug-resistant group (observation group) and sensitive group (control group)，there were 46 patients in the observation group and 52 patients in the control group. DNA of all patients was extracted and the probability of occurrence of GABAARG2 gene was determined by PCR gene sequencing. For each subject，oral antiepileptic drug phenytoin (Phenytoin) was taken to compare the oral absorption rate of drugs of two groups of patients. Results There was no significant difference in age，sex，past history and status of persistent disease between observation group and control group (P>0.05). But the probability of GABAARG2 gene in the observation group was significantly higher than that in the control group，the difference was statistically significant(χ2=8.08，P=0.01). The total oral absorption rate of the observation group(68.71%±12.28%) was significantly lower than that of the control group(82.36%±15.31%)，the difference was statistically significant (χ2=6.78，P=0.01). Conclusion GABAARG2 gene expression in the brain will affect the effect of antiepileptic drugs，it has good reference value for drug resistance in patients.

GABAARG2 gene； Phenytoin； Drug-resistant epilepsy； Pleomorphism

1003-2754(2017)01-0027-04

2016-09-08；

2016-12-21

(云南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650011)

賈 帆，E-mail：sheyinggv@163.com

R742.1

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