李 昱， 張 慧， 林璐璐， 辛世萌， 曹云鵬

Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻粘膜免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠的治療效果研究

李 昱1， 張 慧1， 林璐璐1， 辛世萌1， 曹云鵬2

目的 探討Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻粘膜免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠的治療效果。方法 18只雄性10月齡AD轉(zhuǎn)基因鼠，隨機(jī)分為3組，分別以Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG、空腺病毒載體及Aβ1-42免疫，ELISA法檢測(cè)血清抗Aβ抗體滴度及亞型，Morris水迷宮檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ沉積；ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠腦組織勻漿和血清中可溶性Aβ42水平。結(jié)果 Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組抗體水平隨著免疫次數(shù)逐漸增加，第7次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組血清中抗Aβ抗體水平分別為(67.42±13.68)μg/ml和(94.41±14.01)μg/ml，而空載體組一直在基線水平。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組IgG1/IgG2a比值明顯高于Aβ1-42組(P<0.05)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中Ad-Aβ(3-10)10-CpG組的逃避潛伏期明顯小于空載體組(P<0.01)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG組在靶象限的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于空載體組(P<0.01)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG組穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯多于空載體組(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織Aβ沉積所占面積百分比與空載體組比較明顯減少(P<0.01)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織勻漿和血清中可溶性Aβ42水平明顯高于空載體組(P<0.01)。結(jié)論 Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗鼻粘膜免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠，主要引起Th2型免疫應(yīng)答，可以改善AD轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ清除，可以減少由細(xì)胞免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)。Aβ3-10多價(jià)腺病毒疫苗是AD免疫治療的安全有效的候選疫苗。

阿爾茨海默病； 腺病毒疫苗； Aβ； 免疫治療

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病率高，目前尚無(wú)有效的防治方法。其核心病理改變?yōu)槟X組織Aβ沉積形成老年斑。早期研究發(fā)現(xiàn)，Aβ42主動(dòng)免疫可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑塊清除，改善基因鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能[1]。但后期的臨床試驗(yàn)，由于部分患者中出現(xiàn)亞急性腦膜腦炎而終止[2，3]。推測(cè)這種副作用與Aβ的T細(xì)胞抗原決定簇特異性的T細(xì)胞反應(yīng)或傳統(tǒng)佐劑QS21有關(guān)[3]，后續(xù)的主動(dòng)免疫研究集中在改變免疫原和佐劑來(lái)克服不恰當(dāng)?shù)腡細(xì)胞應(yīng)答引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。Zago等[4]發(fā)現(xiàn)只有針對(duì)Aβ的N末端的抗體可以使腦內(nèi)淀粉樣斑塊清除。針對(duì)Aβ的N末端的DNA疫苗可以改善轉(zhuǎn)基因鼠認(rèn)知功能，促進(jìn)Aβ斑塊清除，減少腦內(nèi)炎癥反應(yīng)[5，6]。

本研究前期工作已成功構(gòu)建編碼10次重復(fù)N末端片段Aβ3-10及CpG序列的新型基因重組腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG，發(fā)現(xiàn)鼻粘膜免疫BALB/c鼠可以誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗Aβ抗體[7]。本研究用這種新型腺病毒疫苗鼻粘膜免疫10月齡的AD轉(zhuǎn)基因鼠，通過(guò)測(cè)定血清抗Aβ抗體水平、腦組織Aβ沉積、血清及腦組織中可溶性Aβ及Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)，探討Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 18只10月齡APPswe/PSEN1dE9鼠，雄性，每只鼠出生后均完成鼠尾DNA鑒定，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。APPswe/PSEN1dE9鼠表達(dá)鼠/人嵌合的淀粉樣蛋白前體(Mo/HuAPP695swe)和突變的人早老素1(PS1- dE9)，這兩種突變與早發(fā)性AD相關(guān)。Aβ1-42多肽(AnaSpect)，人Aβ ELISA試劑盒(Invitrogen，Camarillo，CA)，完全弗氏佐劑(Sigma，USA)，不完全弗氏佐劑(Sigma，USA)，小鼠單克隆抗體(Covance，USA)，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)，Morris水迷宮恒溫游泳池(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，Morris水迷宮分析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及免疫方法 Ad-Aβ(3-10)10-CpG組：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；空載體組：空腺病毒載體10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；Aβ1-42組：免疫方法參照[1]，第1次免疫用50 μl(100 μg)+完全性弗氏佐劑(Sigma，USA)50 μl，股四頭肌肌內(nèi)注射，第2次及以后免疫用Aβ1-4250 μl(100 μg)+不完全性弗氏佐劑(Sigma，USA)50 μl，股四頭肌肌內(nèi)注射。各組均每10 d免疫1次，共免疫7次。每組小鼠免疫前及第2次到第7次免疫后7 d采血，經(jīng)眶靜脈采血，每次采血量約為0.2～0.3 ml。全血室溫下靜置2～3 h，10000 rpm，10 min 離心，留取血清，分裝，-70℃保存。

1.3 ELISA 法測(cè)血清抗Aβ 抗體滴度及亞型 用碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6，0.05 mol/L)將Aβ1-42肽稀釋至5 μg/ml，在96孔酶標(biāo)板每個(gè)孔中加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液(含0.05%TW20的1×PBS)洗板3次。每孔中加入封閉緩沖液(含0.5%BSA，5%羊血清，0.05%TW20的1×PBS)200 μl，室溫孵育1 h。棄去孔中液體，向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)抗體6E10(標(biāo)準(zhǔn)抗體濃度分別為10 ng/ml，7.5 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0 ng/ml)和待測(cè)血清(血清稀釋500～3000倍)50 μl，置于37 ℃孵育1.5 h。棄去血清和抗體，用洗滌緩沖液洗板3次。于各孔中加入稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1000稀釋)，IgG1-HRP(1∶500稀釋)，IgG2a-HRP(1∶500稀釋)，IgG2b-HRP(1∶500稀釋)0.1 ml，置于37 ℃孵育1 h。棄去二抗，洗板5次。于各孔中加入TMB底物溶液0.1 ml，置于37 ℃孵育20 min。于各反應(yīng)孔中加入0.5 mol/L硫酸0.1 ml。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各待測(cè)血清中的抗Aβ抗體濃度。

1.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)基因鼠第7次免疫后1 w進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮恒溫游泳池(直徑1.25 m，高 0.4 m)均分為第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，第Ⅰ象限為靶象限，每次實(shí)驗(yàn)水溫保持在23～26 ℃，水用牛奶染成白色。攝像機(jī)吊于水面上方170 cm處，并通過(guò)配套軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。1 d、2 d是可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，一個(gè)9 cm×9 cm圓形平臺(tái)位于靶象限中心露出水面上1 cm，小鼠分別從4個(gè)象限入水，使小鼠記住平臺(tái)位置。3 d到7 d是隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)，圓形平臺(tái)位于靶象限中心水面下1 cm，每只小鼠從靶象限對(duì)面象限入水，每天進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。記錄小鼠找到平臺(tái)的逃避潛伏期。如果60 s內(nèi)未找到平臺(tái)按60 s計(jì)算，并把小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上逗留30 s。8 d是空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，使小鼠按照從第Ⅰ～Ⅳ象限的順序面對(duì)池壁放入水池，小鼠在無(wú)平臺(tái)情況下尋找記憶中的平臺(tái)，每個(gè)象限游泳60 s，記錄游泳軌跡、穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)、游泳距離、平均速度等。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清和腦組織勻漿可溶性Aβ42采用人Aβ試劑盒，用ELISA法檢測(cè)血清及腦組織勻漿中Aβ42水平。腦組織加入8倍濕重的5 mol/L胍鹽酸/50 mmol/L TrisHCl，用超聲細(xì)胞粉碎儀制成勻漿，室溫下混合3～4 h，取勻漿2.5 μl，加入反應(yīng)緩沖液(5% BSA 0.03% TW-20的Dulbecco’s 磷酸鹽緩沖液，混合1× 蛋白酶抑制劑混合物) 按1∶40稀釋，離心 16 000 r/min，5 min，4 ℃，留取上清，-20 ℃保存。血清離心，取上清20 μl，加入160 μl的5 mol/L胍鹽酸/50 mmol/L TrisHCl，-20 ℃保存。按照試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)，用酶標(biāo)儀(El×800，BIOTEK)測(cè)定450nm處吸光度值(OD)。血清Aβ42水平用pg/ml表示，腦組織Aβ42水平用pg/mg 表示。

1.6 免疫組化法檢測(cè)腦組織內(nèi)Aβ沉積 石蠟包埋的大腦右側(cè)半球，按冠狀位切片，厚約4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%雙氧水37 ℃孵育10 min以阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次，每次5 min；0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修復(fù)，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min；正常羊血清工作液封閉，37 ℃，10 min，傾去勿洗；檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Aβ沉積滴加抗Aβ抗體，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記相應(yīng)的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染5 min，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹(shù)膠封片。圖像分析應(yīng)用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算Aβ斑塊所占面積百分比。

2 結(jié) 果

2.1 血清抗Aβ抗體及抗體亞型檢測(cè) 各組免疫前的血清均未檢測(cè)到抗Aβ抗體，隨著免疫次數(shù)的增加，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組抗體水平逐漸增加，而空腺病毒載體組抗體水平一直呈基線水平。第7次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組血清中抗Aβ抗體水平分別為(67.42±13.68)μg/ml和(94.41±14.01)μg/ml(見(jiàn)圖1)。

圖1 免疫過(guò)程中各組小鼠血清中抗Aβ抗體水平變化

將Aβ1-42組和Ad-Aβ(3-10)10-CpG組小鼠第7次免疫后的血清進(jìn)行抗體亞型分析。產(chǎn)生的抗體有IgG1，IgG2a，IgG2b，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組產(chǎn)生的抗體大部分為IgG1，IgG1/IgG2a比值為(9.85±1.82)；Aβ1-42組的IgG1/ IgG2a比值為(2.08±0.81)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組IgG1/IgG2a比值明顯高于Aβ1-42組(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 血清抗Aβ抗體亞型分析。(A)第7次免疫后血清抗Aβ抗體的IgG1、IgG2a、IgG2b亞型。(B) IgG1/IgG2a比值，與Aβ1-42組比較*P<0.05

2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2.1 可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn) Ad-Aβ(3-10)10-CpG組、Aβ1-42組和空載體組平均逃避潛伏期無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明免疫治療沒(méi)有影響各組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和視覺(jué)(見(jiàn)圖3A)。

2.2.2 隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn) 從3～7 d，各組逃避潛伏期都隨訓(xùn)練次數(shù)增加而縮短。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組的逃避潛伏期明顯小于空載體組(P<0.01)，但Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組無(wú)明顯差異(P>0.05)(見(jiàn)圖3A)。

2.2.3 空間探索實(shí)驗(yàn) Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組在靶象限的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于空載體組(P<0.01)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組無(wú)明顯差異(P>0.05)(見(jiàn)圖3C)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯多于空載體組(P<0.05)，但Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組無(wú)明顯差異(P>0.05)。而游泳距離、平均游泳速度各組間比較無(wú)差異(P>0.05)(見(jiàn)圖3B)。分析游泳軌跡圖：訓(xùn)練早期及空載體組的游泳軌跡主要以游泳池邊緣型為主，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組的游泳軌跡隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多趨向以圍繞平臺(tái)周圍的搜索軌跡為主(見(jiàn)圖3D)。

圖3 免疫后各組APPswe/PSEN1dE9鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)。 (A)可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中各組小鼠逃避潛伏期沒(méi)有明顯差異。隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組逃避潛伏期明顯小于空載體組。(B)空間探索實(shí)驗(yàn)中Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯多于空載體組。(C) Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組在靶象限的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于空載體組。 和空載體組比較*P<0.05，和空載體組比較**P<0.01。 (D) 游泳軌跡圖 (a)Aβ1-42組，(b) Ad-Aβ(3-10)10-CpG組，(c) 空載體組

2.3 血清和腦組織勻漿中可溶性Aβ42水平 Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組腦組織勻漿中可溶性Aβ42水平明顯高于空載體組(P<0.01)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組無(wú)明顯差異(P>0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組血清可溶性Aβ42水平明顯高于空載體組(P<0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組無(wú)明顯差異(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

2.4 免疫治療后轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ沉積變化 在皮質(zhì)及海馬區(qū)各采集4張400倍圖像，用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算Aβ沉積所占面積百分比。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組免疫治療后腦組織Aβ沉積所占面積百分比與空載體組比較明顯減少。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和空載體組相比皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ沉積所占面積百分比為分別減少38.6%和46.2%(P<0.01)。Aβ1-42組和空載體組相比皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ沉積所占面積百分比為分別減少43.8%和50.5%(P<0.01)?？蛰d體組小鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ沉積密集分布，呈深棕褐色，其中散在分布深棕褐色粗大顆粒狀老年斑，皮質(zhì)區(qū)Aβ沉積多于海馬區(qū)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組中Aβ沉積呈稀疏分布，呈淺棕褐色，散在分布淺棕褐色粗大顆粒狀老年斑(見(jiàn)圖5)。

圖4 腦組織勻漿和血漿中可溶性Aβ42水平。Aβ1-42組和Ad-Aβ(3-10)10-CpG組腦組織勻漿(A)和血清(B)中可溶性Aβ42水平明顯高于空載體組，**和空載體組比較P< 0.01，*和空載體組比較P<0.05

圖5 免疫后各組小鼠海馬和皮質(zhì)的Aβ沉積。和空載體組(A1，A2)比較，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組 (B1，B2)和Aβ1-42組 (C1，C2)Aβ沉積明顯減少。 (D) 海馬和皮質(zhì)Aβ沉積面積百分比的定量分析，和空載體組比較**P< 0.01，比例尺代表100μm

3 討 論

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫10月齡APPswe/PSEN1dE9鼠，可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗Aβ抗體，但是抗體水平低于Aβ1-42組，這與既往的基因疫苗結(jié)果類似[8]。免疫治療后IgG的亞型可以間接反映免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的細(xì)胞因子。在小鼠中，Th2型細(xì)胞因子誘導(dǎo)IgG1主要產(chǎn)生，IgG2a反映Th1型細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答[8]。Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫產(chǎn)生的抗體主要為IgG1型，IgG1/ IgG2a比值明顯高于Aβ1-42組。說(shuō)明Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答，從而能避免與細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。而且研究發(fā)現(xiàn)IgG1比IgG2a和 IgG2b清除腦內(nèi)Aβ更有效[9]。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加逐漸縮短，空間探索實(shí)驗(yàn)的穿越平臺(tái)次數(shù)和在靶象限停留時(shí)間與空載體組差異顯著。說(shuō)明免疫治療可以改善轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。這與既往以Aβ為靶點(diǎn)的免疫治療結(jié)果相似[5，6，8，10]。而Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組在水迷宮實(shí)驗(yàn)中主要指標(biāo)差異不明顯，說(shuō)明Ad-Aβ(3-10)10-CpG與Aβ1-42療效大致相似，盡管Ad-Aβ(3-10)10-CpG組小鼠產(chǎn)生的抗體明顯低于Aβ1-42組。

AD的一個(gè)重要機(jī)制就是腦內(nèi)Aβ清除障礙，針對(duì)Aβ的免疫治療能夠促進(jìn)Aβ清除，多種機(jī)制參與，包括小膠質(zhì)細(xì)胞和酶介導(dǎo)的難溶性Aβ降解，可溶的Aβ通過(guò)受體介導(dǎo)吸收入血，通過(guò)毛細(xì)血管周圍和小動(dòng)脈周圍淋巴引流途徑轉(zhuǎn)運(yùn)出腦[11]。Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組免疫治療后腦組織Aβ沉積所占面積百分比與空載體組比較明顯減少，Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組腦組織勻漿和血清中可溶性Aβ42水平明顯高于空載體組，提示免疫治療促進(jìn)腦組織Aβ斑塊解聚，可溶性Aβ42向外周循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)，但Zou等[10]研究顯示免疫治療后腦組織勻漿中可溶性Aβ42與對(duì)照組水平無(wú)差異，其原因可能與腦組織標(biāo)本處理方法有關(guān)。研究表明，抗Aβ抗體可能通過(guò)與直接與Aβ結(jié)合破壞β片層結(jié)構(gòu)導(dǎo)致斑塊解聚[12]，或者通過(guò)免疫球蛋白的F(ab’)2段而非Fc段介導(dǎo)斑塊結(jié)構(gòu)破壞[13]。免疫治療后Ad-Aβ(3-10)10-CpG組和Aβ1-42組血清可溶性Aβ增加，表明“外周沉槽機(jī)制參與腦內(nèi)Aβ斑塊的清除。外周沉槽機(jī)制的過(guò)程是外周循環(huán)的抗Aβ抗體與Aβ結(jié)合形”成免疫復(fù)合物，減少了外周游離Aβ的水平，促進(jìn)Aβ由腦內(nèi)向外周轉(zhuǎn)運(yùn)[14，15]。

綜上所述，基因重組腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9雙轉(zhuǎn)基因鼠，能夠誘導(dǎo)Th2型的免疫反應(yīng)，從而避免細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，并且可以改善APPswe/PSEN1dE9雙轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，減少轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ沉積，促進(jìn)腦內(nèi)Aβ清除。所以，基因重組腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG是一種治療AD安全有效的候選疫苗.

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The therapeutic effect of multivalent adenovirus vaccine Aβ3-10after intranasal inoculation in AD transgenic mice

LIYu，ZHANGHui，LINLulu，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China)

Objective To study the therapeutic effects of multivalent adenovirus vaccine Aβ3-10after intranasal inoculation in AD transgenic mice. Methods Eighteen ten-month old male transgenic mice were divided into three groups randomly and immunized with recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG，empty adenoviral vector and Aβ1-42peptide，representatively. Titers of anti-Aβ antibody and isotypes of immunoglobin in sera were determined with ELISA. Cognitive function of the transgenic mice was detected by Morris water maze tests. Aβ burden in brains of the mice was detected with Immunohistochemistry. Soluble Aβ42in plasma and brain homogenate was detected with ELISA. Results Sera from mice vaccinated with Ad-Aβ(3-10)10-CpG and Aβ1-42showed a steady increase in anti-Aβ antibody titer with each boost，reaching an average of (67.42±13.68) μg/ml and (93.41±14.01) μg/ml after the final immunization，respectively. Antibody titers from mice vaccinated with empty vector remained at background level. IgG1/IgG2a ratio of the Ad-Aβ(3-10)10-CpG group was much greater than that of the Aβ1-42group(P<0.05). Morris water maze tests：Ad-Aβ(3-10)10-CpG immunized mice showed shorter escape latency compared with the empty vector group (P<0.01). Ad-Aβ(3-10)10-CpG immunized mice spent significant more time in the target quadrant than empty vector immunized mice (P<0.01)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG immunized mice crossed the platform location significantly more often than empty vector immunized mice (P<0.05). Percentage of Aβ burden occupied area significantly reduced in mice immunized with Ad-Aβ(3-10)10-CpG compared with empty vector group. Soluble Aβ42levels significantly increased in the brain homogenates and plasma of the Ad-Aβ(3-10)10-CpG immunized mice compared with empty vector immunized mice (P<0.01). Conclusions Intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG could attenuate learning and memory deficts in APPswe/PSEN1dE9 mice and reduce Aβ deposition in the brain of transgenic mice by promoting its clearance. Adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG had low potential to cause cellular immune response mediated inflammatory response. Thus，Ad-×Aβ(3-10)10-CpG is a safe and effective candidate vaccine for immunotherapy in AD.

Alzheimer’s disease； Adenovirus vaccine； β-amyloid； Gene immunization

1003-2754(2017)01-0004-05

2016-07-10；

2016-12 -26

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81371227)

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116027；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

曹云鵬，E-mail：cypcmu@163.com

R749.1+6

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