伍仕鑫， 徐傳飛， 孫磊， 趙旺生， 蔡欣

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010)

伍仕鑫， 徐傳飛， 孫磊， 趙旺生， 蔡欣*

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)一般是指大于200 nt的RNA，位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿中，不參與蛋白質(zhì)編碼，以RNA形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平。哺乳動(dòng)物精子發(fā)生是一個(gè)精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，通過(guò)雄性生殖細(xì)胞分裂和分化形成成熟精子，且精子發(fā)生受到不同階段特異性基因表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控，而特異性基因表達(dá)又受到大量lncRNAs的調(diào)控。雖然lncRNA作為一類重要的基因表達(dá)調(diào)控因子廣泛參與各類生物個(gè)體發(fā)育進(jìn)程和疾病的發(fā)生，但是精子發(fā)生相關(guān)lncRNAs的報(bào)道并不多，且其生物學(xué)功能的研究有待進(jìn)一步深入。因此，本文對(duì)lncRNA的起源、作用機(jī)制和在精子發(fā)生過(guò)程中調(diào)控作用的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)分析。

lncRNA；起源；作用模式；哺乳動(dòng)物；精子發(fā)生

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)占非編碼RNA(ncRNA)的80%，多由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成(Gong & Maqual，2011)，其堿基組成從200 nt到100 000 nt 不等(Brosnan & Voinnet，2009)。LncRNA位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿中，轉(zhuǎn)錄水平低于蛋白質(zhì)編碼基因，不參與蛋白質(zhì)編碼。其以RNA形式在多個(gè)層面(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)上調(diào)控基因的表達(dá)水平(Merceretal.，2009)。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNAs不是基因組的“暗物質(zhì)”，它們?cè)诟鞣N生物過(guò)程中發(fā)揮重要的監(jiān)管作用，包括X染色體失活、基因組印記、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、干細(xì)胞多能性、大腦發(fā)育、視網(wǎng)膜發(fā)育、核運(yùn)輸、熱休克反應(yīng)以及基因組重排(Mattick，2011a，2011b)。在對(duì)若干來(lái)源于多個(gè)小鼠組織的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，大量的lncRNA基因呈現(xiàn)出組織特異性的表達(dá)(Ravasietal.，2006)，隨后有研究者利用原位雜交技術(shù)在小鼠腦組織中鑒定出了大量表達(dá)水平與特定細(xì)胞類型相關(guān)的lncRNAs(Merceretal.，2008)。很多l(xiāng)ncRNAs在染色體上具有特異的基因座位，表明它們的轉(zhuǎn)錄受到動(dòng)態(tài)調(diào)控，這種調(diào)控具有明顯的細(xì)胞特異性(Guttmanetal.，2009)。

目前對(duì)雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中l(wèi)ncRNA的研究日漸增加，但是在精子發(fā)生中只有少數(shù)lncRNAs，如Tsx、HongrES2、Mrhl和Spga-lncRNA被報(bào)道(Ganesan & Rao，2008)。LncRNAs的表達(dá)譜具有組織或細(xì)胞特異性(Rasmussenetal.，2000；Parketal.，2002；Prasanthetal.，2005；Pandeyetal.，2008)，而這在2005年于模式動(dòng)物中才有以組織和細(xì)胞特異性方式表達(dá)的大量lncRNAs被報(bào)道(Inagakietal.，2005)，因此在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中只鑒定出少量的lncRNAs(Ganesan & Rao，2008)。

1 LncRNA來(lái)源及其作用機(jī)制

1.1 LncRNA的起源

大多數(shù)ncRNA受到低程度的進(jìn)化限制，只有小部分在不同物種之間表現(xiàn)出序列保守性(Kutteretal.，2012)。與蛋白質(zhì)編碼基因不同，ncRNA基因不形成大的同源家族。除轉(zhuǎn)位因子外，ncRNA的序列都不具有相似性。LncRNA有以下幾種產(chǎn)生方式：(1)一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因發(fā)生一次框插入，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)與先前編碼序列合并的有功能的lncRNA。參與細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中X染色體失活的X染色體特異性失活轉(zhuǎn)錄物(X inactivation-specific transcript，Xist)是這種生成方式的有力佐證(柏慶然，宋旭，2010)；(2)在染色質(zhì)重排之后，導(dǎo)致2個(gè)原本距離較遠(yuǎn)的非轉(zhuǎn)錄片段串聯(lián)到一起，產(chǎn)生一個(gè)含多個(gè)外顯子的ncRNA。犬科Canidae動(dòng)物睪丸中有一種跨越2個(gè)區(qū)域并被數(shù)十兆核苷酸分開的ncRNA，而在其他真獸類哺乳動(dòng)物中仍保留有祖先染色體的結(jié)構(gòu)，這也是對(duì)染色體重排后產(chǎn)生ncRNA這一推測(cè)的有力佐證；(3)非編碼基因通過(guò)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用復(fù)制，產(chǎn)生一個(gè)有功能的非編碼反義基因，或者產(chǎn)生一個(gè)沒有功能的非編碼反轉(zhuǎn)錄假基因；(4)ncRNA內(nèi)部某段序列的重復(fù)復(fù)制，產(chǎn)生了具有相鄰重復(fù)序列的lncRNA。如在Kcnq1ot1和Xist轉(zhuǎn)錄本的5’端發(fā)現(xiàn)了重復(fù)序列；(5)轉(zhuǎn)座元件插入基因組中產(chǎn)生一個(gè)有功能的lncRNA。如RNABC1(brain cytoplasmic RNA 1)和BC200(brain cytoplasmic RNA 200-nucleotide)這2類ncRNA就源于不同的轉(zhuǎn)座元件(Pontingetal.，2009)。

1.2 LncRNA的基本功能

LncRNA可在多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)水平，主要在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3個(gè)層面上調(diào)控基因的表達(dá)。隨著對(duì)lncRNA研究的深入，許多新的與基因調(diào)控相關(guān)的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，而多年的研究也已經(jīng)證實(shí)lncRNA與表觀遺傳調(diào)控的關(guān)系十分密切(Probstetal.，2009)。在表觀遺傳水平，lncRNA可通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)等機(jī)制影響基因的表達(dá)(Shietal.，2013)。分別與基因組印記和X染色體失活相關(guān)的H19和Xist則是參與表觀遺傳調(diào)控中最先被研究的lncRNAs(Yang & Kuroda，2007)。轉(zhuǎn)錄自同源異型框基因C(homeobox C，HOXC)位點(diǎn)的同源異型框基因反義基因間RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)能夠通過(guò)反式調(diào)節(jié)作用募集多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)并將其定位到HOXD位點(diǎn)，進(jìn)而誘導(dǎo)HOXD基因座上長(zhǎng)達(dá)40 kb的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生表觀遺傳沉默(Jonkersetal.，2008)。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNA可以通過(guò)干擾鄰近基因的表達(dá)、與DNA堿基互補(bǔ)形成復(fù)合物、與轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶Ⅱ相互作用以及作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄(Bonasio & Shiekhattar，2014；Maetal.，2014)。如DNA損傷信號(hào)誘導(dǎo)人類的細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1，Ccnd1)啟動(dòng)子上游一段lncRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白TLS的活性，隨后TLS抑制環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element-binding protein，CREB)的表達(dá)，使Ccnd1基因的表達(dá)沉默(Wangetal.，2008)。在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNA可與microRNA(miRNA)結(jié)合抑制miRNA的功能，或者調(diào)控mRNA的可變剪接，也可與mRNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA，改變其穩(wěn)定性(Yoonetal.，2013)。如具有MRE轉(zhuǎn)錄本的lncRNA在人和鼠的骨骼肌分化過(guò)程中可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA并調(diào)控miRNA及靶基因的表達(dá)(Cesanaetal.，2011)。

2 LncRNA在精子發(fā)生中的調(diào)控功能

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而精巧的過(guò)程，精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)在曲細(xì)精管基底膜增殖并連續(xù)分化成各種生精細(xì)胞，包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和釋放到曲細(xì)精管管腔的成熟精子。成熟精子的形成依賴于精確的轉(zhuǎn)錄程序，并涉及復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程，包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出錯(cuò)都可能導(dǎo)致生精障礙。生精障礙是雄性不育的主要原因，目前雄性不育占全世界診斷不孕病例的一半以上，所以哺乳動(dòng)物成功的精子發(fā)生在生殖發(fā)育以及物種延續(xù)中具有重要作用。最近發(fā)現(xiàn)的lncRNAs作為正常機(jī)體和疾病發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可為解析雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供新的線索。

LncRNA作為新一類重要調(diào)控因子，在精子發(fā)生過(guò)程中的相關(guān)研究較少，目前只有少數(shù)被功能注釋和深入研究，在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中仍有許多潛在的lncRNAs有待鑒定。一些lncRNAs由高通量的方法鑒定，其他的由從頭測(cè)序(denovosequencing)及其功能注釋鑒定。在精子發(fā)生中這些已被鑒定的lncRNA表達(dá)模式在圖2中予以闡明(Luketal.，2014)。對(duì)這些lncRNA調(diào)控作用的解析將為精子發(fā)生相關(guān)的新lncRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定提供參考。

圖2 在精子發(fā)生中的功能特性lncRNAs，其表達(dá)模式與特定的雄性生殖細(xì)胞一同標(biāo)示(Luk et al.，2014)

2.1 LncRNA對(duì)精原干細(xì)胞多能性和分化的影響

原始生殖細(xì)胞隨著雄性動(dòng)物的出生轉(zhuǎn)化為生殖母細(xì)胞，在遷移到生精小管基膜部后分化為SSCs。SSCs位于睪丸曲細(xì)精管靠近基底膜處，是雄性生殖腺內(nèi)的一類原始精原細(xì)胞，其既能自我更新、維持自身群體恒定，又能定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞，SSCs代表了雄性生殖干細(xì)胞(male germline stem cells，mGSCs)有分化為各種雄性生殖細(xì)胞的能力。精子發(fā)生的整體過(guò)程非常復(fù)雜，涉及很多基因的時(shí)序性表達(dá)調(diào)控，而lncRNAs能夠調(diào)控基因的表達(dá)，具有非常廣泛的生物學(xué)功能。目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中在SSCs的分子標(biāo)記、體外培養(yǎng)、增殖分化信號(hào)通路、移植和多能性等方面；到目前為止，關(guān)于lncRNA對(duì)精原干細(xì)胞增殖和分化的研究還較少。近幾年，lncRNA高通量測(cè)序及其數(shù)據(jù)庫(kù)的建立為研究lncRNA的功能提供了很好的平臺(tái)，其中l(wèi)ncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)提供了目前已研究的、在真核動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮功能的lncRNAs的綜合信息。

自我更新和分化是干細(xì)胞的2個(gè)關(guān)鍵特性，而這些特性是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog等的精確轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制維持。最近發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)這些干性維持基因的表達(dá)可以闡明幾個(gè)lncRNAs在維持干細(xì)胞干性中的作用。通過(guò)全基因組篩選結(jié)合小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析以及mESCs轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog基因組位點(diǎn)的染色質(zhì)免疫共沉淀定位，在Oct4和Nanog活躍的結(jié)合位點(diǎn)附近鑒定出4種高保守的lncRNA編碼基因，即AK005651、AK028326、AK043754和AK141205，其中AK028326和AK141205直接與Oct4和Nanog的調(diào)控相關(guān)。這些lncRNA轉(zhuǎn)錄本被敲除或過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Oct4、Nanog和其他細(xì)胞譜系特定基因的表達(dá)水平以及mESCs多向分化潛能的改變(Sheiketal.，2010)?？紤]到lncRNAs在ESCs自我更新、多向分化潛能和分化過(guò)程中普遍發(fā)揮作用，而且ESCs和GSCs中l(wèi)ncRNAs分子水平的作用非常相似，可以預(yù)測(cè)在GSCs發(fā)生分化并獲得ESC樣干性特征的過(guò)程中可能也受到lncRNAs的調(diào)控。

AK011429是一個(gè)被確認(rèn)為細(xì)胞周期蛋白D2(cyclin D2，Ccnd2)的外顯子正義轉(zhuǎn)錄本。AK011429與Ccnd2的表達(dá)譜呈正相關(guān)。而Ccnd2在精原細(xì)胞中高度表達(dá)，并在SSCs自我更新中扮演著一個(gè)重要的角色(Leeetal.，2009)。AK080917是一個(gè)在成年睪丸中下調(diào)的lncRNA，被認(rèn)定為鋅指蛋白的內(nèi)含子4和5與Zbtb16基因之間序列的正義轉(zhuǎn)錄本。Zbtb16在精原干細(xì)胞中高水平表達(dá)，是SSCs干性維持所需的關(guān)鍵基因(Costoyaetal.，2004)。AK080917和Zbtb16之間表達(dá)的正相關(guān)性表明兩者的功能或調(diào)控可能具有相關(guān)性。AK052984是在成年鼠睪丸中高度表達(dá)的lncRNA，來(lái)源于Hoxc4和Smug1基因間的序列。Hoxc4對(duì)于精原干細(xì)胞自我更新是必需的，且在新生兒睪丸中高度表達(dá)(Schmidtetal.，2009)。AK052984的表達(dá)與Hoxc4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此，可以推測(cè)AK052984可能會(huì)影響Hoxc4的表達(dá)。

2.2 LncRNA對(duì)精原細(xì)胞分化的影響

有研究者通過(guò)整合SAGE數(shù)據(jù)(Leeetal.，2006，2009)和全基因組嵌合微陣列數(shù)據(jù)(Leeetal.，2012a)來(lái)鑒定lncRNA，此種方法已經(jīng)用于研究3種關(guān)鍵生精細(xì)胞(A型精原細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的編碼基因。Lee等(2012b)利用上述方法分別在A型精原細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞中鑒定出特異性表達(dá)的50個(gè)、35個(gè)和24個(gè)單外顯子lncRNAs，通過(guò)qPCR、northern blot和RACEs進(jìn)一步驗(yàn)證了精原細(xì)胞中2個(gè)名為Spga-lncRNA1和Spga-lncRNA2的特異性lncRNA在體外細(xì)胞模型中表現(xiàn)出的明顯分化抑制作用，表明它們可能對(duì)于精原細(xì)胞干性的維持具有重要的作用。

與Dsx- and Mab3-related transcription factor-1(Dmrt1)有關(guān)的基因Dmr(Dmrt1-related)是睪丸特異功能lncRNA中一個(gè)有代表性的lncRNA。它在無(wú)意中被發(fā)現(xiàn)，研究者試圖克隆Dmrt1基因，卻在其3’鏈中間區(qū)段發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的具有特定序列的新型RNA異構(gòu)體(Zhangetal.，2010)。通過(guò)基因定位表明此神秘的異構(gòu)體實(shí)際是由5號(hào)染色體上一個(gè)基因編碼的，因此命名為Dmr，而Dmrt1是在19號(hào)染色體上的基因。換句話說(shuō)，Dmr能夠形成一個(gè)反式剪接RNA異構(gòu)體Dmrt1。這種嵌合mRNA的形成干擾Dmrt1的編碼區(qū)和取代Dmrt1的3’-UTR，均導(dǎo)致正常Dmrt1蛋白質(zhì)的下調(diào)。由于Dmrt1蛋白質(zhì)是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子spermatogenesis- and oogenesis-specific basic helix-loop-helix 1(Sohlh1)以維持支持因子的周期性表達(dá)來(lái)促進(jìn)精原細(xì)胞發(fā)育，也可以通過(guò)抑制維甲酸(retinoic acid，RA)依賴性的stimulated by retinoic acid gene 8(Stra8)因子的表達(dá)，從而間接抑制RA的轉(zhuǎn)錄以阻止精原細(xì)胞過(guò)早減數(shù)分裂(Ottolenghietal.，2000，Agboretal.，2013)，此外，通過(guò)特異性敲除支持細(xì)胞中的Dmrt1基因，發(fā)現(xiàn)Dmrt1基因能夠通過(guò)影響支持細(xì)胞的成熟而影響精子發(fā)生(Agboretal.，2013)。所以Drm對(duì)Dmrt1基因的抑制也可能參與到生殖細(xì)胞發(fā)育的有絲分裂和減數(shù)分裂之間的轉(zhuǎn)換中。

當(dāng)Nishant等(2004)在研究小鼠8號(hào)染色體新型減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)一個(gè)17.2 kb的片段時(shí)，鑒定出減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)基因座(meiotic recombination hot spot locus，Mrhl)RNA。Mrhl是一個(gè)位于細(xì)胞核的2.4 kb單外顯子lncRNA，由小鼠基因組編碼，并在睪丸、肝、脾、腎臟中表達(dá)(Nishantetal.，2004)。隨后的研究表明Mrhl RNA可能通過(guò)2種分子機(jī)制調(diào)控精子發(fā)生。一是通過(guò)Drosha分裂Mrhl形成一個(gè)80 nt的RNA中間體。證據(jù)表明這些RNAs都位于GC1精原細(xì)胞系的細(xì)胞核內(nèi)，暗示其與染色質(zhì)可能存在互作的關(guān)系(Ganesan & Rao，2008)。除此之外，Mrhl RNA是第一個(gè)顯示調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)的lncRNA，而Wnt信號(hào)在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中起著非常重要的作用(Kerretal.，2014)。Mrhl可以通過(guò)與p68互作在小鼠精原細(xì)胞的Wnt信號(hào)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。在GC-1 Spg細(xì)胞系中降低Mrhl RNA的表達(dá)，能導(dǎo)致一些與細(xì)胞黏附、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞發(fā)育及分化相關(guān)基因表達(dá)的紊亂，這其中大多是Wnt信號(hào)通路中的基因(Arunetal.，2012)。然而，這個(gè)lncRNA對(duì)精子發(fā)生的調(diào)控作用仍需要通過(guò)基因敲除動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步研究。

2.3 LncRNA對(duì)精母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響

減數(shù)分裂作為雄性生殖細(xì)胞增殖過(guò)程中的一種特殊分裂方式，在精子發(fā)生中受到調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)格調(diào)控。在減數(shù)分裂期間，染色體會(huì)經(jīng)歷包裝、配對(duì)和重組等一系列的結(jié)構(gòu)變化，而染色體域經(jīng)由甲基化的異染色質(zhì)化是這些過(guò)程的必要條件。G9A是一個(gè)在體細(xì)胞常染色質(zhì)區(qū)域參與賴氨酸殘基9單一二甲基化作用的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，已被證明與雄性減數(shù)分裂有關(guān)。敲除G9a基因后會(huì)導(dǎo)致胚胎在妊娠中期死亡，而且G9a基因敲除小鼠的雄性不育可歸因于初級(jí)精母細(xì)胞在減數(shù)分裂粗線期發(fā)生的阻滯(Tachibanaetal.，2007)。如Kcnq1ot1和Air等lncRNAs被發(fā)現(xiàn)與G9a存在交互作用，通過(guò)染色質(zhì)修飾機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄沉默。Kcnq1ot1是小鼠胎盤中一個(gè)源于父本等位基因表達(dá)的90 kb lncRNA，與G9a和PRC2互作，通過(guò)招募多聚復(fù)合物有效地在其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)形成順式抑制結(jié)構(gòu)域(Pandeyetal.，2008)。Air轉(zhuǎn)錄單位在小鼠Igf2r(insulin-like growth factor 2 receptor)基因第二內(nèi)含子啟動(dòng)，并招募G9a到其目標(biāo)啟動(dòng)子使基因沉默(Naganoetal.，2008)。LncRNA和G9a在小鼠生精細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的互作機(jī)制是基于染色質(zhì)重塑器(chromatin remodelling machinery)的募集與轉(zhuǎn)錄抑制。一些已知單倍體雄性生殖細(xì)胞的lncRNAs在成年睪丸組織中上調(diào)表達(dá)，例如Aldoart2、Speer9-ps1；而一些印記lncRNAs下調(diào)表達(dá)，如H19、Meg3和Airn等。早期的研究發(fā)現(xiàn)著名的父本印記基因H19的甲基化在精子發(fā)生過(guò)程中呈連續(xù)性，小鼠H19的甲基化始于胚胎發(fā)育的E15.5期到E18.5期，在出生后的粗線期精母細(xì)胞中則被完全甲基化(Davisetal.，1999)。

Testis-specific x-linked(Tsx)以前被認(rèn)為是一個(gè)位于染色體失活中心的蛋白質(zhì)編碼基因，但隨后被證明是一個(gè)lncRNA。人和小鼠的Tsx基因在外顯子1、3、4、5和6區(qū)域具有非常明顯的高度同源性(Sado & Brockdorff，2013)。Tsx突變雄性小鼠由于粗線期精母細(xì)胞的特異性凋亡導(dǎo)致其睪丸體積明顯比野生型小，表明Tsx參與了雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育，與此同時(shí)，Tsx在粗線期精母細(xì)胞中特異性表達(dá)，而不是在精原細(xì)胞或圓精細(xì)胞期間，暗示其在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中具有一定的調(diào)控作用(Angueraetal.，2011)。TUNEL分析顯示，小鼠Tsx基因敲除后，粗線期精母細(xì)胞凋亡的比例異常高，表明這些lncRNAs在減數(shù)分裂進(jìn)程中至關(guān)重要，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

AK077193是聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白2(synaptonemal complex protein 2，Sycp2)的外顯子反義轉(zhuǎn)錄本，而Sycp2對(duì)于精母細(xì)胞特異性基因在雄性減數(shù)分裂期間的聯(lián)會(huì)復(fù)合體裝配和染色體聯(lián)會(huì)是必需的(Yangetal.，2006)。數(shù)據(jù)顯示AK077193在成年睪丸中上調(diào)表達(dá)，且AK077193和Sycp2之間的表達(dá)呈正相關(guān)(Sunetal.，2013)。因此，可以推測(cè)AK077193有可能調(diào)節(jié)Sycp2的表達(dá)。

2.4 LncRNA對(duì)精子成熟的影響

HongrES2是一個(gè)1 588 bp的lncRNA，在附睪尾區(qū)特異性表達(dá)(Nietal.，2011)。HongrES2作為一個(gè)1.6 kb mRNA-like的前體，可在大鼠附睪中產(chǎn)生一個(gè)新的類似microRNA的小RNA(mil-HongrES2)。附睪特異性羧酸酯酶7(carboxylesterase 7)在HongrES2的3’末端有100%同源的cDNA序列，其蛋白產(chǎn)物可以通過(guò)mil-HongrES2由HongrES2引起下調(diào)，進(jìn)而影響膽固醇酯酶的活性，膜的流動(dòng)性隨精子膜中膽固醇/磷脂類的比例降低而增強(qiáng)，有利于精子的獲能(Zhangetal.，2009)，由此mil-HongrES2能夠參與精子在附睪中的成熟過(guò)程。此外，通過(guò)整體酪氨酸磷酸化水平分析表明，mil-HongrES2的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致精子獲能的弱化(Nietal.，2011)，這表明在附睪中正常的精子成熟過(guò)程中，內(nèi)源性低水平表達(dá)的HongrES2具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。

Narcolepsy candidate-region 1 genes(NLC1-C)是一種僅在精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞表達(dá)的基因間lncRNA，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，其在精子的成熟阻滯(maturation arrest，MA)患者中的表達(dá)量降低，但在細(xì)胞核中的表達(dá)上調(diào)。微陣列分析技術(shù)可見健康對(duì)照者與MA患者的睪丸lncRNA表達(dá)譜之間存在明顯差異(Lüetal.，2015)。NLC1-C在細(xì)胞質(zhì)的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，若被敲除，則細(xì)胞增殖受到抑制并加速凋亡。此外，NLC1-C能夠與位于核仁素的RBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合共同抑制miR-320a和miR-383的轉(zhuǎn)錄，而miR-320a和miR-383在加工成熟后則能直接抑制NLC1-C的作用以此調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活。由此細(xì)胞核內(nèi)NLC1-C的高表達(dá)可以加強(qiáng)對(duì)miR-320a和miR-383的轉(zhuǎn)錄抑制，進(jìn)而導(dǎo)致精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞的過(guò)度增殖和成熟阻滯(Lüetal.，2015)。

2.5 LncRNA與細(xì)胞凋亡

AK005744是一個(gè)源于spermatogenesis associated 17(Spata17)的內(nèi)含子6和7區(qū)域之間的內(nèi)含子反義轉(zhuǎn)錄本，在睪丸中特異表達(dá)和在成年睪丸中上調(diào)；而Spata17是參與雄性生殖細(xì)胞凋亡的睪丸特異性基因，并在成年睪丸中高表達(dá)(Dengetal.，2005；Nieetal.，2013)。AK005744和Spata17表達(dá)譜的正相關(guān)性表明它們之間可能有一定的調(diào)控關(guān)系。LncRNA033862是一個(gè)位于Gfra1內(nèi)的GDNF調(diào)控反義lncRNA轉(zhuǎn)錄本，主要在小鼠睪丸的精原細(xì)胞中表達(dá)。LncRNA033862通過(guò)RNA-DNA相互作用和介導(dǎo)GDNF受體基因Gfra1的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)調(diào)節(jié)SSCs的存活及增殖(Lietal.，2016)。

3 總結(jié)與展望

近年來(lái)，大量研究表明lncRNAs在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，包括精原細(xì)胞增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和圓形精子的形態(tài)變化等一系列過(guò)程。雖然在精子發(fā)生的特定階段有少數(shù)lncRNAs的調(diào)控功能已得到確定，但還有很大一部分與精子發(fā)生相關(guān)的lncRNAs及其具體的調(diào)控功能有待研究。鑒于lncRNAs的重要調(diào)節(jié)作用，基于生物信息學(xué)方法對(duì)lncRNAs的功能注釋和預(yù)測(cè)將是研究lncRNAs功能的主要手段之一。目前關(guān)于lncRNAs的功能注釋方法主要包括基于共表達(dá)、miRNA調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合、表觀遺傳修飾和基于ceRNA調(diào)節(jié)的方法。這些方法在一定程度上對(duì)lncRNAs的功能研究起到推動(dòng)作用。LncRNAs在雄性生殖細(xì)胞研究中作為一個(gè)有吸引力的研究方向，隨著高通量測(cè)序、強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析、ontology數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)RNA結(jié)合模型的應(yīng)用，更多的功能性lncRNAs可以被鑒定。因此，未來(lái)的研究鑒定基因組中以前的“暗物質(zhì)”lncRNAs，必定會(huì)在精子發(fā)生過(guò)程中獲取更多與lncRNAs相關(guān)的研究成果。與此同時(shí)，在生精障礙的情況下盡快鑒定出更多與此相關(guān)的lncRNAs，將有助于男性不育診斷技術(shù)和相關(guān)治療藥物的研發(fā)。

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Progresses of Research on the Function of LncRNA Involved in Mammalian Spermatogenesis

WU Shixin， XU Chuanfei， SUN Lei， ZHAO Wangsheng， CAI Xin*

(College of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang， Sichuan Province 621010， China)

Long non-coding RNA (lncRNA) is the functional RNA segment longer than 200 nucleotides， locating in the nucleus or the cytoplasm， with little or no protein-coding capacity. LncRNAs can regulate gene expression at epigenetic， transcription and post-transcription level. Spermatogenesis is a well-orchestrated biological process， which is composed of meiotic division of spermatocytes and post-meiotic differentiation of haploid spermatids into mature spermatozoa. This process is strictly modulated by phase-specific gene expression under the regulation of plenty of lncRNAs. Although lncRNAs widely participate in various physiological and pathological processes as a new class of important regulatory factors， yet little information is available in the process of spermatogenesis. The identification of spermatogenesis-related lncRNAs and their biological function research are still remaining unknown. Therefore， this article summarized the recent research progresses on the origin and function mechanism of lncRNAs as well as their regulatory roles in spermatogenesis.

lncRNA； origin； mechanism； mammal； spermatogenesis

2016-06-22 接受日期：2016-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572396)

伍仕鑫(1994—), 男, 碩士研究生, 主要從事動(dòng)物分子遺傳學(xué)研究, E-mail：2670809401@qq.com

*通信作者Corresponding author, E-mail：caixin2323@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.201600171

Q752

A

1000-7083(2017)01-0114-07