侯東敏， 章迪， 余婷婷， 王政昆， 高文榮， 朱萬龍*

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學生命科學學院，昆明650500； 2.云南經(jīng)濟管理學院，昆明650106)

冷馴化對中緬樹鼩PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因表達量的影響

侯東敏1， 章迪2， 余婷婷1， 王政昆1， 高文榮1， 朱萬龍1*

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學生命科學學院，昆明650500； 2.云南經(jīng)濟管理學院，昆明650106)

為了研究冷馴化條件下中緬樹鼩Tupaiabelangeri的脂肪組織是否會轉(zhuǎn)化，本研究測定了冷馴化條件下中緬樹鼩脂肪組織質(zhì)量，脂肪轉(zhuǎn)化因子過氧化物酶體增殖激活受體α(PPARα)、環(huán)氧化酶-2(COXⅡ)及過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)基因表達量的變化。結果表明：中緬樹鼩冷馴化組無論是褐色脂肪組織(BAT)質(zhì)量，還是大網(wǎng)膜白色脂肪組織(WAT)質(zhì)量均較對照組顯著增加(P<0.01)，脂肪轉(zhuǎn)化因子PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因表達量也顯著上調(diào)(P<0.01)。以上結果說明中緬樹鼩WAT中PPARα、COXⅡ、PGC-1α基因表達量的增加可能誘導了WAT細胞褐變，進而向BAT細胞轉(zhuǎn)化和提高BAT中解偶聯(lián)蛋白1的表達。

中緬樹鼩；脂肪組織；冷馴化

動物在野外生存面臨許多環(huán)境因子的脅迫，尤其是在冬季，如環(huán)境溫度較低和食物資源較差(Voltura & Wunder，1998)。當環(huán)境溫度較低時，小型哺乳動物會表現(xiàn)出生理、行為等方面的適應性特征變化(Feder & Block，1991)，而這往往會影響其野外的生存策略(朱萬龍等，2008)。生理上，小型哺乳動物通常會在低溫環(huán)境下增加產(chǎn)熱能力，其主要的適應性產(chǎn)熱(非顫抖性產(chǎn)熱)發(fā)生器官是褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)。已有研究表明：低溫條件下小型哺乳動物的白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)可以褐變，進而向BAT轉(zhuǎn)化(Cypessetal.，2009；van Marken Lichtenbeltetal.，2009；Enerback，2010；Birerdincetal.，2013)，從而提高其產(chǎn)熱能力。其中幾種重要的脂肪轉(zhuǎn)化因子起著重要的作用，如COXⅡ和PGC-1α能誘導WAT中BAT細胞的形成(Gestaetal.，2007；Madsenetal.，2010；Vegiopoulosetal.，2010)，PPARα能誘導原代BAT細胞和BAT中解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)的表達(Feder & Block，1991)。這3種轉(zhuǎn)錄因子在冷馴化條件下表達量上調(diào)，可以使WAT褐變向BAT轉(zhuǎn)化，從而增加動物的產(chǎn)熱能力(Birerdincetal.，2013)。

中緬樹鼩Tupaiabelangeri主要棲息在熱帶、亞熱帶地區(qū)，為東洋界特有的小型哺乳動物。研究表明樹鼩科Tupaiidae動物由南向北擴散，即支持“島嶼起源”假說(Olsonetal.，2005)，而本研究組之前的研究也支持這一假說(王政昆等，1994，1995，1999；張武先等，2002)。目前，實驗動物的研發(fā)趨向動物體型小型化發(fā)展，樹鼩因體型較小(一般為80～150 g)、進化地位和靈長類相似、人工繁殖和飼養(yǎng)成本較低，近年來已被廣泛用作生物、醫(yī)學等科學研究的實驗動物(Kawamichi & Kawamichi，1979)。本研究組先前的研究結果指出，中緬樹鼩在冷馴化條件下的產(chǎn)熱、BAT質(zhì)量和UCP1含量顯著增加(王政昆等，1995)，那么在該環(huán)境下中緬樹鼩的WAT是否會向BAT轉(zhuǎn)化，導致BAT質(zhì)量和UCP1含量增加，從而增加其產(chǎn)熱能力？本研究在此假設的基礎上，在冷馴化條件下測定中緬樹鼩的脂肪組織質(zhì)量，脂肪轉(zhuǎn)錄因子PPARα、COX Ⅱ及PGC-1α基因表達量，來驗證低溫條件下中緬樹鼩的WAT是否會褐變，進而向BAT轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 動物來源

中緬樹鼩捕自云南省昆明市祿勸縣的灌叢中，于云南師范大學生命科學學院動物飼養(yǎng)房(昆明)單籠室溫飼養(yǎng)(溫度25 ℃±1 ℃，光照12L∶12D)。飼料為標準的雛雞飼料(昆明生產(chǎn)的產(chǎn)蛋雛雞飼料)，熟喂，自由飲水。實驗動物均為成年非繁殖期個體。

1.2 動物處理

預適應1周后進行正式實驗，隨機分成2組：對照組和冷馴化組(每組各10只)，實驗前，2組動物體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。冷馴化組在溫度5 ℃±1 ℃，光照12L∶12D環(huán)境中馴化28 d；對照組在溫度25 ℃±1 ℃，光照12L∶12D環(huán)境中馴化28 d。馴化期間動物可以自由取食和飲水。2組動物于28 d后斷頸處死，稱量其大網(wǎng)膜WAT和肩胛骨間BAT質(zhì)量，取出皮下WAT于-80 ℃保存，用于相關脂肪轉(zhuǎn)錄因子基因表達量的測定。

1.3 表達量測定

1.3.1 RNA提取及純度鑒定 皮下脂肪組織總RNA的提取與純化根據(jù)RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供的方法進行。通過瓊脂糖凝膠電泳進行RNA純度和完整性檢驗。提取的總RNA置于-80 ℃保存。

1.3.2 cDNA第一鏈合成 第一鏈的合成以皮下脂肪組織總RNA為模板，根據(jù)FastQuant RT Kit(With gDNase)試劑盒提供的方法進行?；蚪MDNA的去除體系包括：2 μL 5×gDNA Buffer，4 μL 總RNA，4 μL Rnase-Free ddH2O，配制體積10 μL，混勻。離心，42 ℃孵育3 min。然后置于冰上。反轉(zhuǎn)錄反應體系包括：2 μL 10×Fast RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，2 μL FQ-RT Primer Mix，5 μL Rnase-Free ddH2O，配制體積10 μL。將反轉(zhuǎn)錄反應中的Mix加到gDNA去除步驟的反應液中，充分混勻。42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA低溫保存。

1.3.3 PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因cDNA序列的擴增 根據(jù)已知脊椎動物PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因氨基酸保守序列設計引物(表1)(章迪等，2014)。以上述cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR，擴增條件均為：95 ℃變性4 min；95 ℃ 30 s，54～56 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，37個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增體系為50 μL： 1 μL模板(10 ng·μL-1)，1 μL上游引物(10 pmol·μL-1)，1 μL下游引物(10 pmol·μL-1)，4 μL dNTP(10 mmol·L-1，pH8.0)，1 μL Taq酶(4 U·μL-1)，5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+)，37 μL ddH2O。擴增產(chǎn)物效果見圖1。

1.3.4 實時熒光定量PCR(FQ-PCR) 模板cDNA用ABI-7000TM實時熒光PCR儀進行擴增，同時檢測熒光信號。FQ-PCR反應體系依照SYBR Green Realmaster Mix試劑盒說明進行配制。反應體系為20 μL：9 μL SYBR Green Realmaster Mix，0.5 μL F引物 (12.5 μmol·L-1)，0.5 μL R引物(12.5 μmol·L-1)，0.5 μL cDNA 模板，9.5 μL RNase ddH2O。擴增條件為第一步94 ℃ 2 min，第二步94 ℃ 15 s，第三步60 ℃ 35 s，第二步到第三步重復37個循環(huán)。1個基因的每個樣本均進行3次實時熒光定量平行重復，采用的數(shù)據(jù)為3次平行測定結果的平均值(朱萬龍等，2014)。內(nèi)參基因引物F：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；引物R：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’。

表1 擴增中緬樹鼩PPARα、COXⅡ、PGC-1α引物

圖1 中緬樹鼩PPARα、COXⅡ、PGC-1α的PCR擴增電泳圖

Fig. 1 PCR electrophoresis of PPARα， COXⅡ and PGC-1α inTupaiabelangeri

1.3.5 2-△△CT相對定量法 目的基因的轉(zhuǎn)錄表達水平采用2-△△CT相對定量法進行計算，用內(nèi)參基因作均一化處理，ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組，2-△△CT可反映出用內(nèi)參基因均一化處理后，該樣本目的基因的初始模板量相對于對照樣本的表達倍數(shù)(差異)(Livak & Schmittgen，2001；Crottetal.，2007；Ornatowskaetal.，2007)。對于對照組樣本，ΔΔCT=0，2-△△CT=1。而對于冷馴化組樣本，若2-△△CT>1，說明該基因表達上調(diào)；若2-△△CT<1，說明該基因表達下調(diào)。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0處理。采用獨立樣本t檢驗對不同組中WAT、BAT質(zhì)量和相關脂肪轉(zhuǎn)化因子表達量的差異進行處理。結果以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，其中P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗前，對照組和冷馴化組中緬樹鼩的體質(zhì)量分別為103.56 g±2.32 g和102.89 g±3.02 g，2組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。冷馴化28 d后，2組脂肪組織質(zhì)量差異有高度統(tǒng)計學意義(BAT：t=-6.92，P<0.01，圖2；WAT：t=-5.56，P<0.01，圖3)，冷馴化組顯著高于對照組，其中BAT質(zhì)量為冷馴化組較對照組升高了85.71%，WAT質(zhì)量則增加了14.14%。

冷馴化28 d后，中緬樹鼩PPARα、COXⅡ和PGC-1α基因表達量顯著高于對照組(PPARα：t=-6.36，P<0.01，圖4：A；COXⅡ：t=-7.44，P<0.01，圖4：B；PGC-1α：t=-2.87，P<0.01，圖4：C)，其中冷馴化組PPARα、COXⅡ和PGC-1α基因表達量分別是對照組的7.68倍、5.65倍和9.98倍。

圖2 冷馴化對中緬樹鼩褐色脂肪組織質(zhì)量的影響

圖3 冷馴化對中緬樹鼩白色脂肪組織質(zhì)量的影響

3 討論

棲息環(huán)境不同，小型哺乳動物在低溫條件下的體質(zhì)量變化模式也不同，有些動物體質(zhì)量變化不明顯，如小林姬鼠Apodemussylvaticus(Klausetal.，1988)和非洲刺毛鼠Acomyscahirinus(Khokhlovaetal.，2001)，而有些動物體質(zhì)量增加，如環(huán)頸旅鼠Dicrostonyxgroenlandicus和金黃倉鼠Mesocricetusauratus(Nagy & Negus，1993)。在本研究中，冷馴化組中緬樹鼩大網(wǎng)膜WAT質(zhì)量顯著增加，和本研究組之前研究結果中中緬樹鼩的體質(zhì)量變化趨勢一致，說明在冷馴化過程中，中緬樹鼩體質(zhì)量的增加可能和體內(nèi)WAT質(zhì)量的增加有關，當然，WAT的增加也和動物在該馴化條件下食物充足、不受限制有關(王政昆等，1995)。動物在低溫條件下，一般會增加其產(chǎn)熱能力來維持生存(Hayes & Chappell，1986)。本研究中，中緬樹鼩在冷馴化條件下，BAT質(zhì)量較對照組顯著增加，說明中緬樹鼩在該條件下增加BAT質(zhì)量，從而增加UCP1的含量，最終增加非顫抖性產(chǎn)熱來應對低溫脅迫，這和本研究組先前的研究結果一致(Zhuetal.，2012)。BAT的質(zhì)量增加可能是中緬樹鼩自身在冷馴化條件下的BAT增生，還有可能是WAT褐變向BAT的轉(zhuǎn)化而來。

圖4 冷馴化對中緬樹鼩PPARα(A)、COXⅡ(B)和PGC-1α(C)基因表達量的影響

脂肪轉(zhuǎn)化因子PPARα、COXⅡ及PGC-1α在WAT向BAT的轉(zhuǎn)變中具有重要作用(Madsenetal.，2010)。PPARα表達量的上調(diào)能誘導原代BAT細胞增生和UCP1的高表達(Barberaetal.，2001；Tongetal.，2005)。COXⅡ?qū)τ赪AT中誘導形成BAT細胞是必需的，有研究表明WAT中誘導出現(xiàn)的BAT細胞中UCP1的表達依賴于COXⅡ(Madsenetal.，2010)。PGC-1α表達過高會使小鼠Musmusculus的WAT中具有UCP1陽性表達的BAT細胞增加(Puigserveretal.，1998)。本研究中，冷馴化28 d后，PPARα mRNA、COXⅡ mRNA及PGC-1α mRNA的基因表達量顯著增加，這可能誘導了中緬樹鼩WAT中BAT細胞的形成，或者使脂肪組織中UCP1含量增加，從而增加其在冷環(huán)境中的產(chǎn)熱能力。

總之，中緬樹鼩在冷馴化條件下通過增加脂肪轉(zhuǎn)錄因子的基因表達量，可能使得WAT細胞褐變增加UCP1表達量，促進了BAT細胞的分化和代謝，彌補中緬樹鼩在冷環(huán)境中適應性產(chǎn)熱的不足，以抵抗低溫環(huán)境。

王政昆， 李慶芬， 孫儒泳. 1995. 中緬樹鼩的非顫抖性產(chǎn)熱及細胞呼吸特征[J]. 動物學研究， 16(3)： 408-414.

王政昆， 李慶芬， 孫儒泳. 1999. 光周期和溫度對中緬樹鼩產(chǎn)熱能力的影響[J]. 動物學報， 45(3)： 287-293.

王政昆， 孫儒泳， 李慶芬. 1994. 中緬樹鼩靜止代謝率的研究[J]. 北京師范大學學報(自然科學版)， 30(3)： 408-414.

張武先， 王政昆， 徐偉江. 2002. 冷馴化對中緬樹鼩能量代謝的影響[J]. 獸類學報， 22(2)： 123-129.

章迪， 張浩， 朱萬龍. 2014. 中緬樹鼩PRDM16、BMP7、PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因的擴增研究[J]. 生物過程， 4(3)： 52-60.朱萬龍， 蔡金紅， 張麟， 等. 2014. 中緬樹鼩體質(zhì)量、血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽表達量的季節(jié)性變化[J]. 生物學雜志， 31(3)： 33-37.

朱萬龍， 王海， 賈婷， 等. 2008. 冷馴化對大絨鼠和高山姬鼠肝臟線粒體呼吸的影響[J]. 四川動物， 27(3)： 371-377.

Barbera MJ， Schluter A， Pedraza N，etal. 2001. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene： a link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell[J]. Journal of Biological Chemistry， 276(2)： 1486-1493.

Birerdinc A， Jarrar M， Stotish T，etal. 2013. Manipulating molecular switches in brown adipocytes and their precursors： a therapeutic potential[J]. Progress in Lipid Research， 52(1)： 51-61.

Crott JW， Liu Z， Choi SW，etal. 2007. Folate depletion in human lymphocytes up-regulates p53 expression despite marked induction of strand breaks in exons 5-8 of the gene[J]. Mutation Research， 626(1-2)： 171-179.

Cypess AM， Lehman S， Williams G，etal. 2009. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans[J]. The New England Journal of Medicine， 360(15)： 1509-1517.

Enerback S. 2010. Human brown adipose tissue[J]. Cell Metabolism， 11(4)： 248-252.

Feder ME， Block BA. 1991.On the future of animal physiological ecology [J]. Functional Ecology， 5(2)： 135-144.

Gesta S， Tseng YH， Kahn CR. 2007. Developmental origin of fat： tracking obesity to its source[J]. Cell， 131(2)： 242-256.

Hayes JP， Chappell MA. 1986. Effects of cold acclimation on maximum oxygen consumption during cold exposure and treadmill exercise in deer micePeromyscusmaniculatus[J]. Physiological Zoology， 59(4)： 453-459.

Kawamichi T， Kawamichi M. 1979. Spatial organization and territory of three shrews (Tupaiaglis)[J]. Animal Behavior， 27(2)： 381-393.

Khokhlova I， Krasnov BR， Shenbrot GI，etal. 2001. Body mass and environment： a study in Negev rodents[J]. Israel Journal Zoology， 47(1)： 1-13.

Klaus S， Heldmaier G， Ricquier D. 1988. Seasonal acclimation of bank voles and thermogenic properties of brown adipose tissue mitochondria[J]. Journal of Comparative Physiology B， 158(2)： 157-164.

Livak KJ， Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod[J]. Methods， 25(4)： 402-408.

Madsen L， Pedersen LM， Lillefosse HH，etal. 2010. UCP1 induction during recruitment of brown adipocytes in white adipose tissue is dependent on cyclooxygenase activity[J]. PLoS ONE， 5(6)： e11391. DOI:10.1371/journal.pone.0011391.

Nagy TR， Negus NC. 1993. Energy acquisition and allocation in male collared lemmingsDicrostonyxgroenlandicus： effects of photoperiod， temperature， and diet quality[J]. Physiological Zoology， 66(4)， 537-560.

Olson LE， Sargis EJ， Martin RD. 2005. Intraordinal phylogenetics of tree shrews (Mammalia： Scandentia) based on evidence from the mitochondrial 12S rRNA gene[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 35(3)： 656-673.

Ornatowska M， Azim AC， Wang X，etal. 2007. Functional genomics of silencing TREM-1 on TLR4 signaling in macrophages[J]. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology， 37(6)： L1377-L1384.

Puigserver P， Wu Z， Park CW，etal. 1998. A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis[J]. Cell， 92(6)： 829-839.Tong Y， Hara A， Komatsu M，etal. 2005. Suppression of expression of muscle-associated proteins by pparalpha in brown adipose tissue[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication， 336(1)： 76-83.

van Marken Lichtenbelt WD， Vanhommerig JW， Smulders NM，etal. 2009. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men[J]. The New England Journal of Medicine， 360(15)： 1500-1508.

Vegiopoulos A， Muller-Decker K， Strzoda D，etal. 2010. Cyclooxygenase-2 controls energy homeostasis in mice bydenovorecruitment of brown adipocytes[J]. Science， 328(5982)： 1158-1161.

Voltura MB， Wunder BA. 1998. Effects of ambient temperature， diet quality， and food restriction on body composition dynamics of the prairie vole，Microtusochrogaster[J]. Physiological Zoology， 71(3)： 321-328.

Zhu WL， Jia T， Huang CM，etal. 2012. Changes of energy metabolism， thermogenesis and body mass in the tree shrew (Tupaiabelangerichinensis) during cold exposure[J]. Italian Journal of Zoology， 79(2)： 175-181.

Effect of Cold Exposure on the Expressions of PPARα， COXⅡ and PGC-1α inTupaiabelangeri

HOU Dongmin1， ZHANG Di2， YU Tingting1， WANG Zhengkun1， GAO Wenrong1， ZHU Wanlong1*

(1.Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-Plants in Southwest Mountain Ecosystem of Yunnan Province Higher Institutes College， School of Life Sciences， Yunnan Normal University， Kunming 650500， China; 2. Yunnan College of Business Management， Kunming 650106， China)

In order to investigate whether the adipose tissue ofTupaiabelangeriwould be transformed under cold acclimation, the mass of adipose tissue， changes of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα)， cyclooxygenase-2 (COXⅡ) and peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1 (PGC-1α) genes were measured in the present study. The results showed that mass of brown adipose tissue and omental white adipose tissue， the mRNA expressions of PPARα， COXⅡ and PGC-1α genes were increased extreme significantly under cold exposure compared with control (P<0.01). And these indicated that the increased expressions of PPARα， COXⅡ and PGC-1α genes under cold condition may cause the transformation of white adipose tissue to browning beige adipocyte， which then transformed to brown adipose tissue and increase the level of uncoupling protein 1 in brown adipose tissue.

Tupaiabelangeri; adipose tissue; cold exposure

2016-08-31 接受日期：2016-11-18

國家自然科學基金項目(31660121); 聯(lián)合支持國家計劃項目(2015GA008); 云南省科技計劃重點項目(2016FA045)

侯東敏(1992—)， 男， 碩士研究生， 研究方向：動物生理生態(tài)， E-mail：houl92@163.com

*通信作者Corresponding author， 男， 副教授， 主要從事動物生理生態(tài)研究， E-mail：zwl_8307@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160232

Q95-33

A

1000-7083(2017)01-0034-05