錢 源，孫 浩，肖 雪，祁文瑾，張 蘭，馬潤玫

·論著·

妊娠期糖尿病孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織全基因組DNA甲基化研究

錢 源1*，孫 浩2，肖 雪1，祁文瑾1，張 蘭1，馬潤玫1

背景 大網(wǎng)膜下脂肪組織與妊娠期糖尿病(GDM)密切相關(guān)，目前，關(guān)于GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織全基因組DNA甲基化研究較少。目的 研究GDM孕婦和無GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織全基因組DNA甲基化差異，為尋找GDM可能的致病基因提供線索。方法 選取2012年1月—2014年5月于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診定期產(chǎn)前檢查并入院分娩的GDM孕婦3例為病例組，同期健康孕婦3例為對(duì)照組。剖宮產(chǎn)術(shù)中剝離大網(wǎng)膜下脂肪組織，提取全基因組DNA。經(jīng)變性和擴(kuò)增后酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，將DNA片段與Illumina Methylation BeadChip芯片進(jìn)行雜交。根據(jù)Methylation Analysis Algorithms 生成各樣本每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，經(jīng)過偏差校正和位點(diǎn)過濾，得到甲基化水平。采用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)具有顯著性差異的甲基化基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號(hào)通路分析。另分別選取同期GDM孕婦和無GDM孕婦各5例，驗(yàn)證候選基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平差異。結(jié)果 病例組1 298個(gè)基因低甲基化，1 570個(gè)基因高甲基化，其中TMEM195、TCF7L2、IGF1、IGF1R甲基化可能與血糖調(diào)控密切相關(guān)，DGKG、NRXN3甲基化可能與體質(zhì)指數(shù)(BMI)密切相關(guān)。GO功能分析顯示，低甲基化基因參與的生物學(xué)過程主要是級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等，細(xì)胞成分主要為細(xì)胞外基質(zhì)；高甲基化基因參與的生物學(xué)過程主要是抗原處理和呈遞、主要組織相容復(fù)合體(MHC)Ⅱ參與的抗原處理和呈遞，細(xì)胞成分主要為肌動(dòng)骨架蛋白、MHC等。KEGG信號(hào)通路分析中，富集數(shù)>20.000的通路有抗原處理和呈遞(富集數(shù)為23.142)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號(hào)通路(富集數(shù)為22.068)。分別選取參與抗原處理和呈遞、PPAR信號(hào)通路中的甲基化差異基因人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)、PPARGC1A進(jìn)行驗(yàn)證。GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織HLA-G啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平高于無GDM孕婦(t=4.968，P=0.001)。兩者大網(wǎng)膜下脂肪組織PPARGC1A啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.929，P=0.380)。結(jié)論 GDM孕婦和健康孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織基因甲基化位點(diǎn)和水平存在顯著差異，甲基化差異基因主要參與抗原處理和呈遞及PPAR信號(hào)通路途徑。

糖尿病，妊娠；DNA甲基化；脂肪組織；抗原呈遞；過氧化物酶體增殖物激活受體；全基因組關(guān)聯(lián)研究

錢源，孫浩，肖雪，等.妊娠期糖尿病孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織全基因組DNA甲基化研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(2)：159-164.[www.chinagp.net]

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妊娠期糖尿病(GDM)指在妊娠過程中發(fā)生的糖耐量異常，是妊娠期常見并發(fā)癥之一。GDM的發(fā)生與糖脂代謝紊亂密切相關(guān)，嚴(yán)重危害母嬰健康。孕婦妊娠前體質(zhì)量、妊娠期體質(zhì)量增加與GDM的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示，大網(wǎng)膜下脂肪組織與代謝相關(guān)疾病具有較高的關(guān)聯(lián)性[1-9]。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的條件下發(fā)生的可遺傳基因表達(dá)的改變，DNA甲基化是其中的一種重要方式。DNA甲基化在脂肪組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，特別是啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可以調(diào)控脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄輔助因子及多種脂肪組織特異性基因的表達(dá)[10-12]，其與GDM的發(fā)生密切相關(guān)。與皮下組織不同，大網(wǎng)膜下脂肪組織在解剖學(xué)上擁有更豐富的血流和神經(jīng)分布，表達(dá)更高的細(xì)胞因子或底物受體，具有更活躍的細(xì)胞代謝活性，使其對(duì)人體交感神經(jīng)系統(tǒng)更敏感，分泌更多的脂肪因子和輸出更多的游離脂肪酸，與代謝相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)更高。目前，對(duì)于妊娠期大網(wǎng)膜下脂肪組織DNA甲基化研究較少，特別是在全基因組水平研究更少。本研究應(yīng)用全基因組DNA甲基化芯片技術(shù)研究GDM孕婦與無GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織的全基因組DNA甲基化水平，對(duì)比和分析兩者中基因甲基化位點(diǎn)和水平的差異，篩選與GDM相關(guān)的目標(biāo)基因，選取可能的候選基因并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證，從而為GDM的預(yù)防、治療，及其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究提供重要線索。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月—2014年5月于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診定期產(chǎn)前檢查并入院分娩的GDM孕婦3例為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)診斷為GDM，既往無高血壓、糖尿病及心、肝、腎疾病，無自身免疫性疾病，無重大疾病家族史。另選取同期健康孕婦3例為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：75 g OGTT正常，既往無高血壓、糖尿病及心、肝、腎疾病，無自身免疫性疾病，無重大疾病家族史。受試者及其家屬對(duì)本研究知情同意，本研究獲得昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 在剖宮產(chǎn)術(shù)中迅速剝離0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的大網(wǎng)膜下脂肪組織，立即存儲(chǔ)于RNAlater中，于-80 ℃超低溫冰箱中凍存。

1.2.2 基因組DNA提取和DNA甲基化水平的檢測(cè) 大網(wǎng)膜下脂肪組織全基因組DNA采用TIANamp 全基因組DNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取。將基因組DNA亞硫酸鹽處理，變性和擴(kuò)增后，采用隨機(jī)內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。將DNA片段與Illumina Methylation BeadChip芯片進(jìn)行雜交，通過芯片上的特異性捕獲探針與互補(bǔ)的酶切基因片段結(jié)合，雜交過夜，清洗后進(jìn)行單堿基延伸和染色，掃描。

1.2.3 差異性基因篩選 將掃描得到的原始數(shù)據(jù)，通過Genome Studio軟件，根據(jù)Methylation Analysis Algorithms 生成各樣本每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，經(jīng)過偏差校正和位點(diǎn)過濾，得到甲基化水平結(jié)果。兩組樣本進(jìn)行配對(duì)的甲基化分析，篩選差異甲基化位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為：α=0.05，β=0.20。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)具有顯著性差異的甲基化基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號(hào)通路分析。

1.2.4 候選基因驗(yàn)證 另分別選取同期GDM孕婦和無GDM孕婦各5例，按上述方法進(jìn)行樣本采集、全基因組DNA提取和亞硫酸鹽處理。 KEGG信號(hào)通路分析中，富集數(shù)>20.000的信號(hào)通路有抗原處理和呈遞、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)。采用Qiagen公司PyroMark PCR kit試劑盒，選取參與抗原處理和呈遞、PPAR信號(hào)通路的基因人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)、PPARGC1A，PyroMark Assay Design Software 2.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，并在擴(kuò)增引物的下游引物序列5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。HLA-G擴(kuò)增引物序列：上游：5′-AAGAGTATAGGAGGATAGGTAAGG-3′，下游：5′生物素標(biāo)記-AACACCATAACCACCATCCTTAAC-3′；測(cè)序引物序列：5′-AAGATTTAGGGAGATATTGAGATAG-3′,5′-ATAGGYGGTGTATGGGTTGGGGAGG-3′，5′-TATTAGGTGATAGGTTTTTAGAGAAG-3′。

PPARGC1A擴(kuò)增引物序列1：上游：5′-GGGTATTAGGGTTGGAATTTAATGT-3′，下游：5′生物素標(biāo)記-CTTCCTTCTAATTATTTCCATTTCTCTCA-3′；擴(kuò)增引物序列2：上游：5′-TTGAAAGGATGGGGTTTTGTG-3′，下游：5′生物素標(biāo)記-AAACTCCTCCACCCAAAATTC-3′；擴(kuò)增引物序列3：上游：5′-AGGGGATTTTGGTTATTATATGGT-3′，下游：5′生物素標(biāo)記-AAACCAACTTTAAATACCACAAACTCTA-3′；測(cè)序引物序列：5′-GTATTTTAAGGTAGTTAGGGA-3′，5′-GTTGATTTGAGTAGAGTAGTA-3′，5′-GGAGTAAAGAAAATTGTAGTAAT-3′，5′-GGATTTTGGTTATTATATGGTTAG-3′。按上述方法檢測(cè)HLA-G、PPARGC1A啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平。PCR條件為95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共55個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min。

2 結(jié)果

2.1 兩組全基因組DNA甲基化水平檢測(cè) 全基因組DNA甲基化水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病例組1 298個(gè)基因低甲基化，1 570個(gè)基因高甲基化。將甲基化差異基因與全基因組多態(tài)相關(guān)比較研究(GWAS)報(bào)道的與肥胖病理特征密切相關(guān)的基因?qū)Ρ群?，發(fā)現(xiàn)共有42個(gè)甲基化差異基因?？赡芘c妊娠期的體質(zhì)量、血壓、心血管疾病、2型糖尿病、血脂和血糖等密切相關(guān)，其中TMEM195、TCF7L2、IGF1、IGF1R甲基化可能與血糖調(diào)控密切相關(guān)，DGKG、NRXN3甲基化可能與體質(zhì)指數(shù)密切相關(guān)(見表1)。

表1 本研究結(jié)果與GWAS發(fā)現(xiàn)的相同甲基化差異基因列表

Table1ThedifferentmethylationgenesofthisstudywhichwereidenticalwithGWAS

與肥胖相關(guān)的病理特點(diǎn)甲基化差異基因遺傳表型體質(zhì)指數(shù)和體質(zhì)量DGKG、NRXN3與體質(zhì)指數(shù)、體質(zhì)量增加和下降相關(guān)代謝綜合征GALNT2、MICB、CAMK2B、TMEM195、TCF7L2與代謝綜合征相關(guān)血壓CNTN4、BAT2、MSRA、C10orf107、PLE?KHA7、FLJ32810、ATP2B1、PTPN11肥胖、高血壓心血管疾病KLHL29、TCF7L2、APOA4、ATP2B1、SMAD3、SMG6、STX16、CUX2、PTPN11心血管疾病的危險(xiǎn)因子，冠心病2型糖尿病RBMS1、MAEA、TCF7L2、GRK5、KCNQ1、CMIP、PALM2、TGFBR3、WISP12型糖尿病的相應(yīng)病癥血脂GALNT2、DNAH11、APOA1、C12orf51、CMIP膽固醇、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油脂肪組織KIAA0495、ZNF608、CNTNAP2、MSRA、BICD2皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪血糖TMEM195、TCF7L2、IGF1、IGF1R空腹血糖胰島素TCF7L2、PCBP3與空腹胰島素、胰島素抵抗相關(guān)

2.2 遺傳信息學(xué)分析 甲基化差異基因的GO功能分析顯示，低甲基化基因參與的生物學(xué)過程主要是級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等，細(xì)胞成分主要為細(xì)胞外基質(zhì)；高甲基化基因參與的生物學(xué)過程主要是抗原處理和呈遞、主要組織相容復(fù)合體(MHC)Ⅱ參與的抗原處理和呈遞，細(xì)胞成分主要為肌動(dòng)骨架蛋白、MHC等。KEGG信號(hào)通路分析中，富集數(shù)>20.000的通路有抗原處理和呈遞(富集數(shù)為23.142)、PPAR信號(hào)通路(富集數(shù)為22.068)。

2.3 驗(yàn)證性分析 分別選取參與抗原處理和呈遞、PPAR信號(hào)通路中的甲基化差異基因HLA-G、PPARGC1A，在5例GDM孕婦和5例無GDM孕婦中進(jìn)行甲基化水平驗(yàn)證。GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織HLA-G啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平為(88.64±12.16)%，高于無GDM孕婦的(60.12±4.12)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.968，P=0.001)。GDM孕婦、無GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織PPARGC1A啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平分別為(35.12±6.28)%、(38.76±6.12)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.929，P=0.380)。

3 討論

GDM代謝紊亂的主要特點(diǎn)是胰島素抵抗。在疾病早期，可通過代償性增加胰島素分泌，產(chǎn)生高胰島素血癥，維持血糖水平正常。當(dāng)該過程發(fā)展到超過機(jī)體代償極限，則表現(xiàn)為2型糖尿病。脂肪細(xì)胞基因組中的甲基化狀態(tài)與體質(zhì)指數(shù)、空腹血糖、胰島素及胰島素抵抗密切相關(guān)，皮下脂肪組織中的瘦素(LEP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)基因啟動(dòng)子的甲基化水平偏低，說明DNA甲基化的異常極可能是導(dǎo)致GDM發(fā)生的重要原因[12]。近年來，隨著高通量DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，啟發(fā)了疾病中DNA甲基化的特點(diǎn)，篩選與疾病相關(guān)的甲基化生物標(biāo)記的研究。

GDM的病因涉及遺傳、環(huán)境、疾病等諸多方面，其發(fā)病機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，到目前為止，尚未完全揭示清楚。表觀遺傳較好解釋了復(fù)雜疾病的“遺傳性丟失”以及不同個(gè)體在GDM易患性上存在的差異，較瘦的個(gè)體也可能會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗和代謝綜合征，并非所有的肥胖個(gè)體均會(huì)發(fā)展成為胰島素抵抗。本研究旨在尋找GDM孕婦與健康孕婦全基因組DNA甲基化具有差異的基因，推測(cè)其可能參與的生物學(xué)過程，并對(duì)信號(hào)通路上的甲基化差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，GDM孕婦共有1 298個(gè)基因低甲基化，1 570個(gè)基因高甲基化。部分差異基因分別參與了糖酵解、三酰甘油合成、三羧酸循環(huán)、脂肪酸β氧化、線粒體電子傳遞以及氧化磷酸化等能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及DNA損傷和修復(fù)過程[13-18]。

本研究將甲基化差異基因與GWAS發(fā)現(xiàn)的表型相關(guān)聯(lián)的基因列表進(jìn)行了對(duì)比，得到GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織中與之相覆蓋的42個(gè)基因。這些基因與個(gè)體的體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù)、血壓、血脂、血糖、空腹胰島素等表型特征密切相關(guān)。提示這些甲基化差異基因可能參與了胰島素抵抗過程，在GDM的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，并有可能是GDM的致病基因。

本研究結(jié)果顯示，在大網(wǎng)膜下脂肪組織中，甲基化差異基因主要參與抗原處理和呈遞以及PPAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。脂肪組織是許多細(xì)胞的混合體，包括脂肪細(xì)胞(占20%～40%)、成纖維細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞和免疫細(xì)胞。本研究結(jié)果是多種細(xì)胞混合檢測(cè)后的結(jié)果。因此，根據(jù)細(xì)胞類型決定其主要的信號(hào)通路，GDM孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織中以抗原處理和呈遞、PPAR信號(hào)通路為主。該結(jié)果與高甲基化差異基因GO功能分析相近，與GDM的病理特征一致。

GDM的病理特征之一為常伴有不同于感染、損傷等應(yīng)激因素作用下的炎性反應(yīng)[19]。肥胖所致的脂肪組織炎癥可能是胰島素抵抗的首要原因[20]。據(jù)報(bào)道，脂肪組織的缺氧和過氧化反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體的自然免疫和低度炎性疾病，并且由脂肪組織中的免疫細(xì)胞參與了自然免疫和誘發(fā)炎癥的過程[21]。參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞主要是脂肪組織中的免疫細(xì)胞，HLA是該過程中的重要分子成分。HLA是目前已知的最為復(fù)雜的調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答和決定疾病易患性個(gè)體差異的主要基因系統(tǒng)。HLA參與的抗原處理和呈遞信號(hào)通路所致的炎癥在GDM中具有重要作用[22]。推測(cè)該信號(hào)通路上的差異基因異常表達(dá)引起機(jī)體產(chǎn)生特異的慢性炎癥，成為GDM疾病特征之一。

GDM的另一病理特征為患者體內(nèi)存在糖脂代謝紊亂及高胰島素，PPAR信號(hào)通路是導(dǎo)致糖脂代謝紊亂和高胰島素的重要通路。PPAR是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族，受到相應(yīng)配體激活后，可與靶基因啟動(dòng)子內(nèi)的反應(yīng)原件結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。PPAR信號(hào)通路具有多重生物功效，能增強(qiáng)脂肪組織對(duì)胰島素的敏感性，促進(jìn)脂肪分解，保持葡萄糖的合成以及分解平衡，以及抑制炎癥[23]。推測(cè)該信號(hào)通路上的基因甲基化升高或降低，影響相應(yīng)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂，誘發(fā)GDM的發(fā)生、發(fā)展。

PPAR信號(hào)通路中的PPARGC1A基因富含于脂肪組織中，PPARGC1A是一種轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子，與糖皮質(zhì)激素受體等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后參與體內(nèi)能量代謝。抗原處理和呈遞信號(hào)通路中的HLA-G屬非典型HLAⅠ類分子，是重要的免疫耐受分子，在妊娠期特異出現(xiàn)。本研究分別選取了參與兩條信號(hào)通路中的基因進(jìn)一步驗(yàn)證，考慮到基因不同區(qū)域甲基化的差異以及啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與表達(dá)的相互關(guān)系，僅研究了候選基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。GDM孕婦HLA-G高甲基化水平可能是通過參與調(diào)控機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)，從而影響GDM過程。PPARGC1A與人體胰島素釋放有關(guān)，其甲基化水平與胰島素抵抗密切相關(guān)，推測(cè)該基因的甲基化水平可能是通過調(diào)控體內(nèi)的糖脂代謝，引起胰島素抵抗，引發(fā)GDM的發(fā)生、發(fā)展。但在本研究中，GDM孕婦與健康孕婦PPARGC1A甲基化水平未見差異，可能是由于驗(yàn)證的樣本例數(shù)較少，需增加更多樣本量進(jìn)一步討論其差異性。

綜上所述，本研究采用基因芯片對(duì)GDM孕婦和健康孕婦大網(wǎng)膜下脂肪組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者基因的甲基化位點(diǎn)和水平存在顯著差異；甲基化差異基因主要參與抗原處理和呈遞及PPAR信號(hào)通路途徑。

編后語：

該結(jié)論為更加準(zhǔn)確分析GDM的發(fā)病機(jī)制和尋找可能的候選基因提供了依據(jù)，并為研究GDM的致病機(jī)制提供思路。由于取樣困難，本研究納入的樣本量較少，且驗(yàn)證的候選基因選取數(shù)量較少，并未完全驗(yàn)證多數(shù)甲基化差異基因，無法對(duì)信號(hào)通路上差異基因進(jìn)行系統(tǒng)研究。未來需選取可能與表型和功能密切相關(guān)的差異基因，驗(yàn)證后進(jìn)行信號(hào)通路研究，在細(xì)胞和動(dòng)物模型上進(jìn)行功能研究，以進(jìn)一步探討GDM發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：錢源進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、質(zhì)量控制、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；孫浩負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析；肖雪負(fù)責(zé)基因組甲基化水平檢測(cè)；祁文瑾、張?zhí)m負(fù)責(zé)樣本收集；馬潤玫負(fù)責(zé)課題內(nèi)容咨詢。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Whole Genome DNA Methylation in the Visceral Omental Adipose Tissue of Patients with Gestational Diabetes Mellitus

QIANYuan1*，SUNHao2,XIAOXue1,QIWen-jin1,ZHANGLan1,MARun-mei1

1.OfficeofPrenatalDiagnosis,DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032,China2.InstituteofMedicalBiologyChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Kunming650031,China

*Correspondingauthor：QIANYuan，Associatechieftechnician；E-mail：yuanqian2x@hotmail.com

Background The visceral omental adipose tissues were closely associated with gestational diabetes mellitus(GDM).Till now,there had been few reports about genome-wide methylation profile in visceral omental adipose tissues of GDM.Objective To investigate the pathogenesis of GDM by measuring and comparing the genome-wide DNA methylation patterns in visceral omental adipose tissues between pregnant women with GDM and the normal pregnancies,in order to provide the clues for explaining the mechanism and process of GDM.Methods Pregnant women who accepted regular prenatal examination and hospital delivery in Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2012 to May 2014 were enrolled.Three cases of GDM were enrolled as GDM group,while three cases of healthy pregnant women as control group.The visceral omental adipose tissues were obtained at time of term caesarean section.The genome-wide DNA of these tissues were extracted.The products were cleaved after degeneration and amplification.The DNA fragment were hybridized with Illumina Methylation BeadChip chip.The methylation level of each gene sites were calculated according to Methylation Analysis Algorithms with deviation correction and infiltration.DAVID database was used to carry out Gene Ontology(GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) signaling pathway analysis in methylation gene with significant difference.Five cases of pregnant women with and without GDM in the same period were selected to verify the difference of methylation level of candidate gene promoter region.Results 1 298 genes were hypomethylated and 1 570 genes were hypermethylated in GDM group.Among them,the methylation of TMEM195,TCF7L2,IGF1 and IGF1R might be closely associated with regulation of blood glucose level.The methylation of DGKG and NRXN3 might be closely associated with BMI.The GO function analysis supported that the genes with hypomethylation were mainly involved in the biological processes,such as the regulation of cascade reaction activity,the regulation of cell apoptosis and protein transport,the cellular components were mainly extracellular matrix.The biological processes involved in the hypermethylated genes were mainly antigen processing and presentation,and antigen processing and presentation participated by major histocompatibility complex(MHC) Ⅱ.The main cellular components were muscle actin cytoskeleton proteins,MHC and so on.In the analysis of KEGG signal pathway,the pathway of enrichment >20.000 had antigen processing and presentation(23.142),PPAR(22.068).The different methylation gene HLA-G and PPARGC1A were respectively selected from antigen processing and presentation and PPAR signal pathway to validate.The methylation level of HLA-G promoter region in the visceral omental adipose tissues of GDM pregnant women was higher than non GDM pregnant women(t=4.968，P=0.001).There was no statistically significant difference in the methylation of PPARGC1A promoter region between GDM pregnant women and non GDM pregnant women(t=0.929，P=0.380).Conclusion There are statistically significant difference in gene methylation sites and levels between GDM and healthy pregnant women.The different methylation gene mainly involve in antigen processing and presentation and PPAR signaling pathway.

Diabetes,gestational；DNA methylation；Adipose tissue；Antigen presentation；Peroxisome proliferator-activated receptors；Genome-wide association study

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360103)；云南省科技廳(2012FB039)——昆明醫(yī)學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)資金項(xiàng)目；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)&協(xié)和青年基金資助項(xiàng)目(33320140013)

R 714.256

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.02.008

2016-02-10；

2016-09-30)

1.650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷室

2.650031云南省昆明市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

*通信作者：錢源，副主任技師；E-mail：yuanqian2x@hotmail.com