徐 成，張根葆，周淑艷，桑金鳳

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.病理生理學(xué)教研室；3.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

AAVC-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制研究

徐 成1，張根葆2,3，周淑艷2，桑金鳳2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.病理生理學(xué)教研室；3.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

目的：探討皖南五步蛇蛇毒抑瘤組分Ⅰ(AAVC-1)誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用，并分析其可能的線粒體機(jī)制。方法：以不同作用濃度的AAVC-1處理A549細(xì)胞，采用Annexin V /PI雙染流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡百分率；JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體的膜電位變化，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞色素C在線粒體內(nèi)的分布。結(jié)果：不同濃度梯度AAVC-1 1.0、3.0、9.0、20.0 μg/mL處理24 h后，與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞早期凋亡率明顯增加(P<0.05)；線粒體膜電位綠色熒光百分比由(23.01±6.07)%上升至(87.26±9.54)%(P<0.01)，熒光顯微鏡觀察到綠色熒光增強(qiáng)；免疫組化顯示，隨著AAVC-1濃度增加，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C平均光密度值明顯增加(P<0.05)。結(jié)論：AAVC-1可以通過(guò)降低線粒體膜電位和促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活線粒體通路誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌A549的凋亡。

五步蛇毒抑瘤組分Ⅰ；非小細(xì)胞型肺癌；線粒體；細(xì)胞凋亡

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.01.002

肺癌是威脅人類健康和生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，有報(bào)道指出我國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率有明顯增高的趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞型肺癌的惡性程度最高，對(duì)放化療均不敏感，預(yù)后最差[1]。因此，尋找有效安全的抗腫瘤藥物是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。蛇毒生物學(xué)活性廣泛，是一種天然的藥用資源，富含多種酶類、蛋白質(zhì)和多肽，具有鎮(zhèn)痛、抗凝、抗血栓、抗腫瘤等功效[2-3]，其中抗腫瘤效應(yīng)已越來(lái)越受到重視[4]。本實(shí)驗(yàn)室前期從皖南地區(qū)五步蛇粗毒中分離純化了一種抑瘤組分Ⅰ(Agkistrodonacutusvenom-1，AAVC-1)，研究表明，AAVC-1可以劑量依賴性抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的體外增殖和誘導(dǎo)其凋亡，但其確切的機(jī)制尚不清楚[5]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討AAVC-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制，為AAVC-1可能的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品和儀器 五步蛇蛇毒抑瘤組分Ⅰ(AAVC-1)凍干粉由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供。無(wú)支原體胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI 1640(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibcobrl)、JC-1檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞色素C單克隆抗體、Annexin V- FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑均購(gòu)自浙江碧云天生物技術(shù)研究所(進(jìn)口分裝產(chǎn)品)；免疫組化試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品；MUSE智能觸控細(xì)胞分析儀(德國(guó)，Milipore公司)，倒置熒光顯微鏡(日本，OLYMPUS IX51)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)，Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人肺癌細(xì)胞A549由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所留存,細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI1640中,置于5%CO2，恒溫37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組(加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液),實(shí)驗(yàn)組(分別加入1.0、3.0、9.0、20.0 μg/mL AAVC-1)，以及CCCP組(CCCP，作為一種質(zhì)子載體,強(qiáng)效的線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，可使線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的膜電位徹底喪失[6])。

1.3 方法

1.3.1 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞樣本均分3份。處理細(xì)胞及加入試劑的具體操作參照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明。細(xì)胞消化、離心，收集懸浮細(xì)胞，棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。用400 μL 1X Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1 × 106/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8°C避光條件下孵育15 min。 加入10 μL PI后輕輕混勻于2～8°C避光條件下孵育5 min。使用MUSE智能觸控細(xì)胞分析儀分析樣本。樣本最少細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。以上檢測(cè)重復(fù)3遍。

1.3.2 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位變化 依據(jù)JC-1檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞,將細(xì)胞接種于6孔板,分別設(shè)置對(duì)照組(加入等量的培養(yǎng)基),CCCP(1 μg/mL CCCP處理20 min)以及不同濃度的AAVC-1(1.0、3.0、9.0、20.0 μg/mL)實(shí)驗(yàn)組,37℃孵育24 h，重復(fù)3次，熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位改變,用Image pro plus 6.0 軟件的Color Histogram模板計(jì)算出5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，以平均熒光強(qiáng)度做統(tǒng)計(jì)分析,定量線粒體膜電位水平。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)胞質(zhì)細(xì)胞色素C(cyto.c)含量 制備細(xì)胞爬片，待鋪滿60%～80%后棄原培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3次，再加0.5%Triton X-100，室溫下封閉15 min，PBS洗3次，加入抗細(xì)胞色素C兔單克隆抗體1∶200(陰性對(duì)照組加PBS)，37℃過(guò)夜，PBS洗3次，再加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃孵育30 min，PBS洗3次，加 DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色，蘇木精復(fù)染，水洗，1%鹽酸酒精分化，酒精梯度脫水，最后中性樹(shù)膠封片，倒置顯微鏡觀察拍照,用Image pro plus 6.0 軟件的Color Histogram模板計(jì)算出5個(gè)視野平均光密度值，以平均光密度值來(lái)定量細(xì)胞色素C表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 AAVC-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡 AAVC-1作用于A549 細(xì)胞24 h后，利用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，左下限為正常細(xì)胞群，右下限為早期凋亡細(xì)胞群，右上限為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞群[7]。結(jié)果如圖1所示，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加。當(dāng)AAVC-1在1.0 ～ 20.0 μg/mL范圍時(shí)，A549細(xì)胞早期凋亡率分別為0.99%、2.60%、5.69%、7.88%、16.74%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡無(wú)明顯改變。

A:對(duì)照組；B～E:AAVC-1 1.0、3.0、9.0、20.0 μg/mL處理組。

圖1 AAVC-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞早期凋亡的百分率

2.2 AAVC-1對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響 JC-1是一種用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，可以檢測(cè)細(xì)胞組織或純化的線粒體膜電位[6]。當(dāng)線粒體膜電位水平較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，呈高紅低綠；當(dāng)膜電位水平較低時(shí)，JC-1主要以單體形式存在于胞質(zhì)中，呈高綠低紅。各組A549細(xì)胞綠色熒光百分比見(jiàn)表1，隨著AAVC-1濃度的增加，綠色熒光逐漸增強(qiáng)(P<0.05和P<0.01)，提示AAVC-1處理的A549細(xì)胞的線粒體膜電位水平明顯下降(圖2)。

組別綠色熒光百分比/%Control11.00±4.06AAVC-11.0μg/mL23.01±6.07*AAVC-13.0μg/mL51.61±6.99**AAVC-19.0μg/mL64.05±6.20**△AAVC-120.0μg/mL87.26±9.54**△CCCP92.62±12.26**F值86.513P值0.000

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01；與AAVC-1 1.0 μg/mL 組比較，△P<0.05。

A:對(duì)照組；B～E:AAVC-1 1.0、3.0、9.0、20.0 μg/mL處理組;F:CCCP組。

圖2 AAVC-1對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響(200×)

2.3 AAVC-1增加A549細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C的釋放 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組AAVC-1孵育A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃染顆粒，鏡下細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)染色加深，隨AAVC-1濃度的增加，細(xì)胞色素C平均光密度值也逐漸升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，邊界清晰，胞質(zhì)內(nèi)黃染顆粒不明顯。

組別平均光密度值Control0.05±0.02AAVC-11.0μg/mL0.37±0.10*AAVC-13.0μg/mL0.44±0.43**AAVC-19.0μg/mL0.54±0.84**AAVC-120.0μg/mL0.79±0.10**F值8.587P值0.000

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

細(xì)胞線粒體是細(xì)胞能量供應(yīng)的場(chǎng)所，氧化磷酸化、電子傳遞、三羧酸循環(huán)等均依賴線粒體，當(dāng)線粒體膜結(jié)構(gòu)或功能受到破壞時(shí)，能量代謝異常，可引起細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道指出，線粒體死亡途徑是細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要機(jī)制之一[8]，當(dāng)Bax蛋白和線粒體膜上的電位依賴性離子通道相結(jié)合，膜通透性改變，線粒體的膜電位Δψm降低，細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子AIF從線粒體釋放入胞質(zhì)，在dATP或ATP的作用下，和凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1結(jié)合，激活下游的casapase-9，三者形成凋亡復(fù)合體，再進(jìn)一步激活關(guān)鍵的凋亡蛋白casapase-3，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡[9-10]。AAVC-1是從皖南五步蛇粗毒中分離純化的一種抑瘤組分，具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的效應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了AAVC-1的促細(xì)胞凋亡作用，20.0 μg/mL AAVC-1可使人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞早期凋亡百分率達(dá)16.97%。JC-1熒光探針用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞膜電位改變，當(dāng)線粒體的膜電位較高時(shí)，JC-1主要以聚合物的形式聚集在胞質(zhì)中，呈紅色熒光；當(dāng)膜電位濃度降低時(shí)，JC-1以單體的形式，散在分布于胞質(zhì)中，呈綠色熒光[6]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度AAVC-1處理24h均會(huì)引起A549細(xì)胞線粒體膜電位Δψm降低，綠色熒光百分比高于對(duì)照組(P<0.05和P<0.01)；實(shí)驗(yàn)還觀察到AAVC-1各濃度組(1.0～20.0 μg/mL)引起線粒體膜電位降低的程度小于CCCP組(P<0.05)，提示AAVC-1可以誘導(dǎo)線粒體膜電位的降低，但未使線粒體膜電位徹底崩潰。同時(shí)，免疫組化結(jié)果也顯示實(shí)驗(yàn)組AAVC-1孵育A549細(xì)胞24 h后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃染顆粒，細(xì)胞色素C平均光密度值也明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，AAVC-1可以通過(guò)降低A549細(xì)胞線粒體膜電位Δψm，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從細(xì)胞線粒體釋放至胞質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

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Mitochondrial mechanism of AAVC-1 induced apoptosis in A549 cells

XU Cheng,ZHANG Genbao,ZHOU Shuyan,SANG Jinfeng

School of Clinical Medicine,Wanan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To investigate the apoptosis pathway and mechanisms of human non-small cell lung cancer A549 cells induced by anticoagulant fraction fromAgkistrodonacutusvenom(AAVC-1).Methods:Different dose of AAVC-1 was used to treat A549 cells,and the apoptosis percentage of A549 cells was assessed by flow cytometry with annexin V/PI double staining.Mitochondrial trans-membrane potential(Δψm)of A549 cells was measured by JC-1 fluorescence probe and microscopy,and distribution of cytochrome C in the mitochondria was detected by immunohistochemistry after AAVC-1 treatment.Results:The early apoptosis rate of A549 cells was significantly increased after treatment with different dose of AAVC-1 for 24 h as compared with the control group(P<0.05).The fluorescence green intensity was increased from(20.13±1.6)% to(89.12±1.2)%(P<0.01),and fluorescence spectroscopy indicated intensified intracellular green fluorescence.Immunohistochemical test revealed markedly increased average light density of cytochrome C with added dose of AAVC-1 treatment(P<0.05).Conclusion:AAVC-1 can induce the apoptosis of human non-small cell lung cancer A549 cells by reducing the mitochondrial membrane potential and promoting the release of cytochrome C.

Agkistrodonacutusvenomantitumor component 1;non-small cell lung cancer;mitochondria;apoptosis

1002-0217(2017)01-0005-04

皖南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研資助項(xiàng)目(RG20151204);安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2011A266)

2016-09-23

徐 成(1993-)，女，2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，(電話)18356976912，(電子信箱)1165911631@qq.com； 張根葆，男，教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)zgb858@163.com，通信作者。

R 734.2

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