林秀潔 黃禮傳 張 俊

(福州神經(jīng)精神病防治院神經(jīng)科，福建 福州 350008)

急性腦梗死患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中組蛋白H3乙酰化水平的變化

林秀潔 黃禮傳 張 俊

(福州神經(jīng)精神病防治院神經(jīng)科，福建 福州 350008)

目的 探討急性腦梗死患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中組蛋白H3乙?；阶兓c急性腦梗死的臨床關(guān)系。方法 選取2015年1～12月該院神經(jīng)內(nèi)科收治的發(fā)病后不同時(shí)間段的急性腦梗死患者206例為腦梗死組；選取同期在該院腦卒中篩查門診就診的60名健康志愿者為對(duì)照組。密度梯度法離心分離PBMC，提取全組蛋白，Western印跡檢測(cè)組蛋白H3乙酰化水平；根據(jù)患者就診時(shí)的癥狀與體征，進(jìn)行牛津郡社區(qū)腦卒中項(xiàng)目(OCSP)分型，并采用神經(jīng)功能缺損程度評(píng)估(NIHSS)量表評(píng)估患者的神經(jīng)功能缺損程度。結(jié)果 急性腦梗死后1 d開始，持續(xù)到7 d，PBMC組蛋白H3乙?；骄黠@低于對(duì)照組(P<0.05)，其中梗死后第3天蛋白H3值最低。不同OCSP分型患者組蛋白H3乙?；骄黠@低于對(duì)照組(P<0.05)；其中完全前循環(huán)腦梗死(TACI)組蛋白H3乙?；浇档头茸畲螅黠@低于后循環(huán)腦梗死組和部分前循環(huán)腦梗死組(P<0.05)。多元直線回歸分析顯示，PBMC組蛋白H3乙?；绞侨朐杭毙阅X梗死患者NIHSS評(píng)分的重要影響因素，兩者呈明顯直線負(fù)相關(guān)(β=-0.283，P=0.001)。結(jié)論 急性腦梗死患者PBMC中組蛋白H3乙?；降陀诮】等巳?，且以TACI型和神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重患者的PBMC中組蛋白H3乙?；较陆底顬槊黠@。

腦梗死；組蛋白；乙?；饔?/p>

組蛋白乙酰化可通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)來影響基因表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔1〕。雖然研究顯示，在氧糖剝奪(OGD)細(xì)胞和大腦中動(dòng)脈阻斷實(shí)驗(yàn)(MCAO)大鼠腦組織中組蛋白乙?；骄黠@降低〔2〕，并且給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷動(dòng)物乙?；敢种苿┛捎行嵘M蛋白乙?；?，通過抗感染、抗氧化應(yīng)激等作用改善神經(jīng)系統(tǒng)功能〔3〕。但關(guān)于急性腦梗死患者組蛋白水平具體如何仍不清楚。研究已證實(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中表觀遺傳性變化與腦組織中一致〔4〕。本次研究以PBMC為材料，觀察急性腦梗死患者PBMC中組蛋白H3乙酰化水平變化情況，探討其與急性腦梗死的臨床關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1～12月本院神經(jīng)內(nèi)科收治的發(fā)病后1、3、5、7、14 d的急性腦梗死患者206例為腦梗死組。入選患者均經(jīng)頭顱CT、磁共振成像(MRI)檢查證實(shí)；簽署知情同意書并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；排除合并腦出血、惡性腫瘤、自身免疫性疾病者。其中男138例，女68例；年齡55～83〔平均(64.31±8.05)〕歲。選取同期在本院腦卒中篩查門診就診的60名健康志愿者為對(duì)照組，其中男44例，女16例；年齡58～79〔平均(64.12±9.17)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 分型與標(biāo)本采集 腦梗死組根據(jù)就診時(shí)的癥狀與體征，進(jìn)行牛津郡社區(qū)腦卒中項(xiàng)目(OCSP)分型：完全前循環(huán)腦梗死(TACI)組36例，部分前循環(huán)腦梗死(PACI)組128例，后循環(huán)腦梗死(POCI)組42例。此外。對(duì)上述患者進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)估(NIHSS評(píng)分)?；颊呷朐? d內(nèi)取肘靜脈血3 ml，對(duì)照組入組時(shí)取肘靜脈血3 ml，收集到的血液標(biāo)本均在6 h內(nèi)完成PBMC分離。

1.2.2 組蛋白提取 密度梯度法離心分離PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，使用總組蛋白提取試劑盒(艾美捷科技有限公司)提取蛋白：每份PBMC標(biāo)本中加入100 μl裂解緩沖液，冰上裂解10 min，10 000 r/min離心60 s，棄上清后加入50 μl裂解緩沖液，冰上裂解30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清，加12 μl硫蘇糖醇(1∶500稀釋)。二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)測(cè)定各樣本蛋白濃度，-20℃保存。

1.2.3 組蛋白H3乙?；瘷z測(cè) Western印跡檢測(cè)組蛋白H3乙?；?，2.5 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.22 μm孔徑)，室溫下5%脫脂牛奶封閉60 min，加入兔組蛋白H3(H3)(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗3次，10 min/次，加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫下孵育60 min，TBST洗膜緩沖液洗3次，10 min/次，化學(xué)發(fā)光試劑顯色。乙?；鞍譎3(Ac-H3)檢測(cè)與上述過程相似，Ac-H3抗體亦為1∶500稀釋。Image J 軟件分析H3、Ac-H3 Western印跡檢測(cè)圖片灰度值，Ac-H3/ H3的比值為組蛋白H3乙酰化水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、Pearson分析、多元回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 急性腦梗死后不同時(shí)間點(diǎn)組蛋白H3乙酰化水平變化 對(duì)照組組蛋白H3乙?；綖?.23±0.09；急性腦梗死發(fā)病后1、3、5、7、14 d分別為：0.12±0.08、0.08±0.03、0.13±0.05、0.14±0.05、0.17±0.03。急性腦梗死后1 d開始，持續(xù)到7 d，組蛋白H3乙?；骄黠@低于對(duì)照組(P<0.05)。其中梗死后第3天組蛋白H3水平最低。見圖1。

圖1 急性腦梗死后組蛋白H3乙?；絼?dòng)態(tài)變化

2.2 不同OCSP分型患者組蛋白H3乙酰化水平 不同OCSP分型患者組蛋白H3乙?；骄黠@低于對(duì)照組(0.23±0.09)(P<0.05)；TACI組蛋白H3乙?；?0.09±0.05)降低幅度最大，明顯低于PACI組(0.13±0.04)和POCI組(0.16±0.07)(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同OCSP分型患者PBMC組蛋白H3乙?；?/p>

2.3 神經(jīng)功能損傷程度與組蛋白H3乙?；降年P(guān)系 患者年齡、性別、糖尿病、高血壓、心血管疾病、組蛋白H3乙?；降扰cNIHSS評(píng)分相關(guān)的變量單因素分析見表1。為進(jìn)一步消除混雜因素干擾，以房顫、組蛋白H3乙?；綖樽宰兞?，NIHSS評(píng)分為因變量進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果顯示，組蛋白H3乙?；绞侨朐杭毙阅X梗死患者NIHSS評(píng)分的重要影響因素(P=0.001)，呈明顯負(fù)相關(guān)，見表2。

表1 急性腦梗死患者以NIHSS評(píng)分為因變量單因素分析

表2 急性腦梗死患者以NIHSS評(píng)分為因變量多元回歸分析

3 討 論

目前雖然已逐漸探明急性腦梗死后的病理機(jī)制以及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載、血腦屏障受損等，但多數(shù)有效治療方案仍受限于時(shí)間窗。表觀遺傳學(xué)研究顯示，具有遺傳性的基因組表觀修飾包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色體重排等，任意一種修飾異常均會(huì)誘發(fā)自身免疫、腫瘤、神經(jīng)病變等疾病〔5〕。其中組蛋白修飾包括乙?；⒘姿峄?、糖基化等，而乙?；茄芯枯^為系統(tǒng)的表觀遺傳，其可通過調(diào)整組蛋白末端殘基上乙?；鶖?shù)量來改變?nèi)旧w構(gòu)型，調(diào)整基因表達(dá)〔6〕；以組蛋白乙?；癁橹委煱悬c(diǎn)具有很大的潛在價(jià)值。相關(guān)研究已證實(shí)，組蛋白去乙?；敢种苿┰谌毖阅X損傷動(dòng)物模型和OGD細(xì)胞模型中具有明顯療效〔7〕。但以上兩種模型無法完全模擬腦梗死后患者的病理生理過程，因此需進(jìn)一步對(duì)患者本身組蛋白乙酰化情況進(jìn)行了解。

盡管本次研究發(fā)現(xiàn)了急性腦梗死患者PBMC組蛋白H3乙?；矫黠@低于健康人群，其中以TACI型患者及NIHSS評(píng)分高的患者H3乙?；较陆底顬槊黠@這一現(xiàn)象，但仍有很多工作需要進(jìn)一步完善。例如由于受目前檢測(cè)組蛋白乙?；椒椒ǖ南拗?，較難開展大樣本量的研究分析，而本次研究樣本量偏下，結(jié)果可能存在偏差。此外，雖然相關(guān)研究顯示，組織中多數(shù)HDACS活性明顯提升可能是導(dǎo)致心肌缺血性損傷后組織中組蛋白乙?；较陆档脑颉?〕，亦有研究在急性缺血性腦損傷中證實(shí)了以上現(xiàn)象〔9〕，但引發(fā)急性腦梗死患者PBMC組蛋白H3乙酰化水平降低的原因仍待進(jìn)一步闡明。

1 Doherty R,O'Farrelly C,Meade KG,etal.Epigenetic regulation of the innate immune response to LPS in bovine peripheral blood mononuclear cells(PBMC)〔J〕.Vet Immunol Immunopathol,2013;154(3/4):102-10.

2 Brown M,Postlethwaite AE,Myers LK,etal.Supernatants from culture of typeⅠ collagen-stimulated PBMC from patients with cutaneous systemic sclerosis versus localized scleroderma demonstrate suppression of MMP-1 by fibroblasts〔J〕.Clin Rheumatol,2012;31(6):973-81.

3 Ghosh S,Zang S,Mitra PS,etal.Global gene expression and Ingenuity biological functions analysis on PCBs 153 and 138 induced human PBMC in vitro reveals differential mode(s)of action in developing toxicities〔J〕.Environ Int,2011;37(5):838-57.

4 Pujari R,Eligar SM,Kumar N,etal.CD45-mediated signaling pathway is involved in Rhizoctonia bataticola lectin(RBL)-induced proliferation and Th1/Th2 cytokine secretion in human PBMC〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,2012;419(4):708-14.

5 Ilavarasi K,Kiruthiga PV,Pandian SK,etal.Hydroxytyrosol,the phenolic compound of olive oil protects human PBMC against oxidative stress and DNA damage mediated by 2,3,7,8-TCDD〔J〕.Chemosphere,2011;84(7):888-93.

6 Mihály J,Gericke J,Trocsik D,etal.Reduced lipoxygenase and cyclooxygenase mediated signaling in PBMC of atopic dermatitis patients〔J〕.Prostagland Other Lipid Mediat,2013;107:35-42.

7 Sabo TJ,Dinovic VM,Kaluderovic GN,etal.Syntheses and activity of some platinum(IV)complexes with N-methyl derivate of glycine and halogeno ligands against HeLa,K562 cell lines and human PBMC〔J〕.Inorgan Chim Acta,2005;358(7):2239-45.

8 Wieczorek L,Brown BK,Delsarto-Macedo C,etal.Mitigation of variation observed in a peripheral blood mononuclear cell(PBMC)based HIV-1 neutralization assay by donor cell pooling〔J〕.Virology,2013;447(1/2):240-8.

9 Welker MW,Welsch C,Ochs D,etal.Comparison of envelope 2 CD81 binding regions in PBMC-derived versus serum-derived hepatitis C virus isolates:higher conservation of CD81 region 2 in PBMC isolates〔J〕.J Viral Hepat,2011;18(3):181-92.

〔2016-10-23修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:2014D013)

林秀潔(1974-)，女，主治醫(yī)師，主要從事精神疾病研究。

R743.33

A

1005-9202(2017)02-0336-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.031