孫 靜 任熙玲 曹珮華 武永紅

(西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021)

來那度胺對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長的影響

孫 靜 任熙玲 曹珮華 武永紅

(西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021)

目的 探討來那度胺對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用及其可能機(jī)制。方法 利用MTS法檢測來那度胺對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響；實(shí)時(shí)定量PCR、Western印跡檢測來那度胺作用于SMMC-7721細(xì)胞后血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。結(jié)果 50 μmol/L 的來那度胺對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖有抑制作用；實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡結(jié)果顯示，以25、50、100 μmol/L 來那度胺處理SMMC-7721細(xì)胞12 h后，VEGF mRNA表達(dá)水平顯著減低(P<0.05)；Western印跡結(jié)果表明，25、50、100 μmol/L 來那度胺處理SMMC-7721細(xì)胞24 h后，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 來那度胺可能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成發(fā)揮雙重抗腫瘤作用。

來那度胺；肝癌；血管內(nèi)皮生長因子

肝癌(HCC)是最常見，最具侵襲力的惡性腫瘤之一〔1，2〕。臨床治療HCC的首選方案是手術(shù)，但由于其起病隱匿發(fā)現(xiàn)時(shí)大多屬于中晚期，失去手術(shù)時(shí)機(jī)〔3〕。因此,存在手術(shù)禁忌證、不可切除的、失去手術(shù)時(shí)機(jī)晚期HCC的首選治療方法是動(dòng)脈介入化療栓塞術(shù)(TACE)。但HCC對(duì)傳統(tǒng)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，且敏感度低，因此臨床迫切需要尋找一種新的化療藥物。來那度胺是沙利度胺的新一代衍生物，具有抑制血管生成和免疫調(diào)節(jié)作用，是一種新型抗腫瘤藥物。它應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤，療效顯著，但其在HCC的研究與應(yīng)用少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討來那度胺對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；來那度胺、二甲基亞砜購自美國Sigma公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；MTS溶液、總RNA Kit購自美國Promega公司；鼠抗人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株以含有10%小牛血清，1%青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱，隔1天換液1次，2～3 d進(jìn)行一次傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，接種于96孔板，濃度為每孔2 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞24 h。移去上清液，以25、50和100 μmol/L來那度胺處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為不加藥物組。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTS溶液，每孔20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，搖床低速振蕩10 min，測量各孔在490 nm處吸光值。增殖率=(各組所得到的吸光值/空白對(duì)照組平均值)×100%。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 取對(duì)數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞，以1×105/ml，1 ml接種于6孔板中，將培養(yǎng)體系最終調(diào)整為2 ml，培養(yǎng)細(xì)胞24 h。移除上清液，以RPMI 1640稀釋的來那度胺處理細(xì)胞，藥物終濃度分別為25、50和100 μmol/L。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為不加藥物組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)試劑盒說明書以總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA、反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行20 μl體系實(shí)時(shí)定量PCR操作。VEGF基因引物及內(nèi)參 GAPDH 基因引物由華大基因公司設(shè)計(jì)合成，VEGF正義鏈5'AGGGCAGAATCATCACGAAGT 3'；反義鏈5'AGGGTCTCGATTGGATGGCA3'；GAPDH正義鏈5'GCACCGTCAAGGCTGAGAAC5'，反義鏈5'TGGTGAAGACGCCAGTGGA3'。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，30 s；變性95℃，30 s；延伸58℃，34 s；循環(huán)45 個(gè)；GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GraphPad.Prism.v5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法計(jì)算〔3〕。

1.2.4 Western印跡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板，密度為1×105/ml，培養(yǎng)細(xì)胞24 h。移除上清液，以25、50和100 μmol/L來那度胺處理細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為不加藥物組。裂解細(xì)胞提取總蛋白并測定蛋白濃度，取變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn) PVDF膜，封閉、洗膜后與VEGF、GAPDH一抗4℃孵育過夜，洗膜后加二抗，37℃孵育1 h，蛋白質(zhì)印跡檢測采用化學(xué)發(fā)光劑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 來那度胺對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的作用 對(duì)照組細(xì)胞增殖率為(93.5±4.9)%，25、50、100 μmol/L組細(xì)胞增殖率為(78.5±6.4)%、(56.0±5.7)%、(32.5±3.5)%來那度胺可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖(P<0.05)。

2.2 來那度胺對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株VEGF mRNA表達(dá)水平的影響 以25、50和100 μmol/L來那度胺處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞12 h后，VEGF mRNA表達(dá)水平分別為(14.0±2.8)、(5.5±0.7)、(3.5±0.7)，較對(duì)照組(18.0±1.4)明顯下調(diào)(P<0.05)，表明來那度胺可呈劑量依賴性明顯下調(diào)VEGF。

2.3 來那度胺對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)水平的影響 以25、50和100 μmol/L來那度胺處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h后，Western印跡結(jié)果顯示，VEGF 蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，說明來那度胺可呈劑量依賴性下調(diào)VEGF，結(jié)果見圖1。

1:對(duì)照組;2:來那度胺25 μmol/L;3：來那度胺50 μmol/L；4：來那度胺100 μmol/L圖1 來那度胺對(duì)SMMC-7721 VEGF蛋白表達(dá)的作用

3 討 論

近年來，來那度胺作為沙利度胺新一代的衍生物頗受關(guān)注，它在多種血液系統(tǒng)腫瘤的治療中得到了廣泛的研究和應(yīng)用〔4～6〕,同時(shí)對(duì)于實(shí)體腫瘤的治療研究也有報(bào)道〔7〕。本研究結(jié)果表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，來那度胺可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，而且這種抑制增殖的作用隨著藥物濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的最主要原因，而腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移都伴隨血管新生?？寡苄律强鼓[瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要策略之一。VEGF是一種重要的腫瘤新生血管分子標(biāo)志〔8〕，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、加強(qiáng)血管新生，增加血管通透性。本研究表明，在不同濃度的來那度胺作用下，肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平隨藥物濃度增加明顯下調(diào)。綜上所述，沙利度胺可能通過抑制腫瘤細(xì)胞生長、抗血管生成而發(fā)揮雙重抗腫瘤的作用。進(jìn)一步研究來那度胺抗腫瘤的詳細(xì)分子機(jī)制，對(duì)來那度胺治療肝癌的臨床應(yīng)用具有重要意義。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011;61(2)：69-90.

2 Bruix J，Gores GJ，Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma：clinical frontiers and perspectives〔J〕.Gut，2014;63(5)：844-55.

3 Livak KJ,Schmittqen TD.Analysis of relative gene expression data using real-Time quantitative PCR and the 2-△△Ct method〔J〕.Methods，2001；25(3)：402-8.

4 Rosovsky R，Hong F，Tocco D，etal.Endothelial stress products and coagulation markers in patients with multiple myeloma treated with lenalidomide plus dexamethasone:an observational study〔J〕.Br J Haematol，2013；160(2):351-8.

5 Coman T，Bachy E，Michallet M，etal.Lenalidomide as salvage treatment for multiple myeloma relapsing after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation:a report from the French Society of Bone Marrow and Cellular Therapy〔J〕.Haematologica，2013；98(5):776-83.

6 Riches JC，Ramsay AG，Gribben JG.Immune reconstitution in chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Curr Hematol Malig Rep，2012;7(1)：13.

7 Brosseau C,Colston K,Dalgleish AG,etal.The immunomodulatory drug lenalidomide restores a vitamin D sensitive phenotype to the vitamin D resistant breast cancer cell line MDA-MB-231 through inhibition of BCL-2:potential for breast cancer therapeutics〔J〕.Apoptosis,2010;17(2):164-73.

8 趙建龍,王胐胐,李世朋,等.VEGF、LYVE-1 在肝癌組織中的表達(dá)與意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014;34(8):2167-9.

〔2015-04-22修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢(mèng)園)

孫 靜(1977-)，女，副教授，在讀博士，主要從事腫瘤分子影像學(xué)研究。

R735

A

1005-9202(2017)02-0323-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.027