張 斌

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

顯齒蛇葡萄提取物的體內(nèi)和體外降血糖效果

張 斌

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

目的 探討不同顯齒蛇葡萄提取物體外降血糖及抗氧化和體內(nèi)降血糖效果研究。方法 利用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇提取顯齒蛇葡萄中的活性成分，得到不同提取物，測定其中總酚和總黃酮的含量，考察對α-葡萄糖苷酶的抑制效果和對DPPH及ABTS的清除效果，體內(nèi)降血糖效果是利用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)和70%的乙醇提取物(EE)按劑量200 mg/kg體重治療4 w，每周末尾部動脈取血測定血糖，4 w后眼眶取血測定血清胰島素。結(jié)果 不同提取物中，EE中總酚類物質(zhì)和總黃酮來物質(zhì)的含量最高，其次是ME，HE中該兩種成分含量最低，體外降血糖效果發(fā)現(xiàn)EE對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性并且體現(xiàn)劑量依賴性，體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)EE對DPPH和ABTS具有較強的清楚效果，而體內(nèi)降血糖效果發(fā)現(xiàn)不同提取物對糖尿病小鼠具有一定的降血糖效果，特別是EE組降血糖效果非常明顯，血清胰島素的含量得到明顯提高。結(jié)論 顯齒蛇葡萄70%EE具有明顯的抗氧化和降血糖效果，是一種具有很大潛力的降血糖和抗氧化的天然藥物。

顯齒蛇葡萄；降血糖；α-葡萄糖苷酶；抗氧化

糖尿病及其并發(fā)癥嚴重威脅人類健康，在各類疾病中死亡率居第3位〔1〕。植物提取物的降血糖作用已得到證實〔2～5〕。顯齒蛇葡萄屬于葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，主要分布于華中和西南等省少數(shù)民族地區(qū)，民間作為茶飲用植物已有上千年的應(yīng)用歷史〔6〕。研究表明，顯齒蛇葡萄葉中主要次生代謝物以黃酮類化合物為主，含量達到45.52%〔7〕，其中以二氫楊梅素含量最高，是天然的抗氧化劑?，F(xiàn)代藥理研究表明，顯齒蛇葡萄具有抗氧化，抑菌消炎，降血脂降血壓和護肝效果〔8～11〕。民間常作為降血糖藥物來治療糖尿病，但是至今還沒有相關(guān)報道，本研究觀察顯齒蛇葡萄的不同提取物體外和體內(nèi)降血糖效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 顯齒蛇葡萄采集于信陽，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校李成宏老師鑒定為葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，憑證標本保存在漯河醫(yī)專植物標本館內(nèi)。嫩葉在50℃～60℃烘干后用中藥粉碎機粉碎過60目篩，備用。清潔級健康KM小白鼠，雄性體質(zhì)量(20±2)g，由河南斯萊克竟達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCKK(豫)2009-0010，分籠飼養(yǎng)，飼料充足飲水不限，室溫20℃～25℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實驗。阿卡波糖，α-葡萄糖苷酶，鏈脲佐菌素(STZ)均購自Sigma公司，鹽酸二甲雙胍購自重慶科瑞制藥有限責任公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 AL104電子天平(Mettler-Toledo儀器公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取機(北京弘祥生物技術(shù)開發(fā)公司)；Free Style 利舒坦雅培血糖儀(美國Abbott Diabetes Care公司)；DU-800紫外掃描分光光度計(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的提取 準確稱取顯齒蛇葡萄葉粉末2 000 g 5份，分別用20倍體積的正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇浸泡24 h后，利用循環(huán)超聲波提取儀提取45 min，減壓濃縮回收得提取物，再經(jīng)過冷凍干燥得到5個提取物，分別是正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)以及70%乙醇提取物(EE)。

1.3.2 總酚和總黃酮的含量以及對DPPH和ABTS清除率的測定 顯齒蛇葡萄不同提取物中的總酚和總黃酮的含量測定參照文獻〔12〕進行測定。另外，DPPH和ABTS自由基清除作用依照文獻〔12〕方法進行測定，對DPPH清除時不同提取物的濃度為5～500 μg/ml，對ABTS清除時不同提取物的濃度為1～50 μg/ml，用BHT作為對照。

1.3.3 體外降血糖效果評價 參照參考文獻〔9〕的測定方法，略作修改。分別取60 μl不同提取待測液(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/ml樣品液、阿卡波糖溶液以及蘆丁溶液，同量的緩沖液作為空白對照)于96孔酶標板中，加入50 μl α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/ml)，振勻后于37℃水浴保溫10 min，加入50 μl 5.0 mmol/L PNPG溶液振勻，在37℃水浴中反應(yīng)20 min，加入160 μl Na2CO3溶液(0.2 mol/L)終止酶促反應(yīng)，置于405 nm 波長處測吸光度(A)。由于顯齒蛇葡萄提取物本身有顏色，因此每個樣品需要測定背景吸收，并最終測定結(jié)果進行校正。每個樣品重復(fù)3 次取平均值。抑制率(%)=(A0-AS)/A0 ×100%。式中：AS為樣品組吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.3.4 顯齒蛇葡萄提取物體內(nèi)降血糖效果檢測 100只KM小鼠禁食12 h后，注射STZ 150 mg/kg(用pH4.5的檸檬酸鈉溶液配制成),72 h后，尾部動脈取血測定血糖含量，血糖含量>11.1 mmol/L為造模成功的小鼠〔12〕。

選取小鼠80只，隨機分為8組，正常組(蒸餾水)，控制組，二甲雙胍組(30 mg/kg體重)，以及顯齒蛇葡萄不同提取物(200 mg/kg體重)劑量組，小鼠分籠飼養(yǎng)，每天按劑量給藥1次，自由進食、飲水。實驗周期4 w，在實驗1、2、3、4 w末尾靜脈采血，測空腹血糖。實驗第4周末，乙醚麻醉小鼠后摘取眼眶取血，血樣4℃3 500 r/min離心10 min后取血清用來測定血清胰島素水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 顯齒蛇葡萄不同提取物中總酚和總黃酮含量以及對DPPH和ABTS清除率的測定 70%EE中的總酚和總黃酮含量均為最高，而其他提取物中的總酚和總黃酮含量是不同的，利用體外抗氧化實驗如對DPPH和ABTS的清除效果評價提取物的活性，從IC50的只可以看出，70%EE對DPPH和ABTS具有明顯的清除效果。其他提取物對DPPH和ABTS的清楚效果是根據(jù)總酚和總黃酮的含量呈正相關(guān)?？偡雍涂傸S酮含量越高，清除效果越好，說明總酚和總黃酮是顯齒蛇葡萄中的主要起作用的物質(zhì)。見表1。

表1 顯齒蛇葡萄中不同提取物總酚、總黃酮含量以及DPPH和ABTS的IC50值

與BHT比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 不同提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制 不同提取物中，EE對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最好，其次是ME，抑制效果最差的是HE，說明高含量的總酚類物質(zhì)和總黃酮類物質(zhì)的提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制具有較強的活性，另外每種提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨著劑量的增大，抑制活性隨著增大，說明顯齒蛇葡萄提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性是劑量依賴型的。比較不同質(zhì)量濃度顯齒蛇葡萄、阿卡波糖和蘆丁對α-葡萄糖苷酶抑制活性可看出，隨質(zhì)量濃度增加，EE和ME對α-葡萄糖苷酶抑制活性好于蘆丁，但低于阿卡波糖。見圖1。

2.3 不同提取物體內(nèi)降血糖效果研究 與正常組比較，STZ致糖尿病小鼠的血糖含量明顯升高，經(jīng)過4 w的治療后，與控制組比較，經(jīng)過不同提取物的治療發(fā)現(xiàn)，各治療組的糖尿病小鼠的血糖含量顯著降低(P<0.01)，且EE-200 mg/kg劑量組小鼠的血糖含量與二甲雙胍組小鼠的血糖含量在4 w后比較相近，結(jié)果說明顯齒蛇葡萄具有較強的降血糖效果，并且體現(xiàn)為70% EE的降血糖效果最佳。見表2。

圖1 不同提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果

組別0w1w2w3w4w正常組65±0576±0875±0668±0865±03控制組225±18248±08256±13176±14285±13二甲雙胍組218±164179±042)168±132)159±141)87±142)HE組215±05206±031)196±182)195±051)175±112)CE組233±21225±15206±151)195±141)175±182)EAE組244±15228±13195±122)178±16149±212)ME組234±08218±11185±122)168±08135±142)EE組225±15205±071)165±112)135±062)89±142)

與控制組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 不同提取物對糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響 糖尿病小鼠血清中的胰島素含量〔(21.4±2.7)mIU/L〕明顯低于正常小鼠〔(51.2±3.5)mIU/L〕血清中的血清，說明經(jīng)過STZ造模后，胰島細胞遭到破壞，抑制胰島素的分泌，經(jīng)二甲雙胍和不同提取物的4 w治療，二甲雙胍組〔(36.8±3.1)mIU/L〕小鼠中血清含量明顯提高(P<0.01)，但是HE組〔(23.6±2.5)mIU/L〕和CE組〔(24.1±2.4)mIU/L〕小鼠血清中胰島素的含量提高不大，說明這兩個提取物對糖尿病小鼠治療效果不明顯，而EAE組〔(31.2±2.8)mIU/L〕、ME組〔(32.4±2.6)mIU/L〕和EE組〔(40.5±2.4)mIU/L〕小鼠血清中的胰島素含量得到明顯提高(P<0.01,P<0.05)，尤其是EE組小鼠血清中的胰島素提高幅度較大，僅次于二甲雙胍組中的含量。

3 討 論

本文結(jié)果說明顯齒蛇葡萄中主要活性物質(zhì)是酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)成為當今研究熱點，尤其在降血糖、抗氧化等方面取得了顯著的成果〔13,14〕，本研究發(fā)現(xiàn)不同提取物中70%EE中的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量最高，并且對DPPH和ABTS呈現(xiàn)了極高的清除效果。α-葡萄糖苷酶主要是催化淀粉(多糖)分解成單糖尤其是葡萄糖〔15〕。多種抑制劑如阿卡波糖和伏格列波糖都可以抑制α-葡萄糖苷酶，延緩雙糖(淀粉在淀粉酶作用下水解為雙糖)在α-葡萄糖苷酶作用下分解為單糖，延緩葡萄糖與果糖的吸收速度，從而降低餐后血糖，實驗發(fā)現(xiàn)，不同提取物對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制效果，但是EE的抑制效果最好，接近阿卡波糖的抑制效果，從而降低餐后的高血糖。糖尿病小鼠經(jīng)過顯齒蛇葡萄提取物4 w治療后，小鼠中血糖含量明顯減低，可能是顯齒蛇葡萄提取物作為抗氧化劑防止胰腺β-細胞進一步受損的同時刺激受損胰腺β-細胞的修復(fù)和刺激胰腺β-細胞大量分泌胰島素。另外，胰島素的分泌能夠刺激肝糖原的合成和抑制肝糖原磷酸化酶〔16〕，促進肝糖原的沉積，有利于血糖的降低。

1 Bottini N,Vang T,Cucca F,etal.Role of PTPN 22 in type 1 diabetes and other autoimmune diseases〔J〕.Semin Immunol,2006;18(4):207-13.

2 Kalivani A,Umamaheswari A,Vinayagam A,etal.Anti-hyperglycemic and antioxidant properties of cassia auriculata leaves and flowers on alloxan inuced diabetic rats〔J〕.Pharmacologyonline,2008;21(1):204-17.

3 Kandasamy M,Veerendra Y,Deepak KD,etal.Antioxidant and antihyperlipidemic status of heliotropium zeylanicum extract on streptozotocin-induced diabetes in rats〔J〕.Biol Pharm Bull,2006;29(11):2202-5.

4 Shu XS,Lv JH,Tao J,etal.Antihyperglycemic effects of total flavonoids from polygonatum odoratum in STZ and alloxan-induced diabetic rats〔J〕.J Ethnopharmacol,2009;124(3):539-43.

5 Dong HQ,Li M,Zhu F,etal.Inhibitory potential of trilobatin from Lithocarpus polystachyus rehd against a-glucosidase and a-amylase linked to diabetes〔J〕.Food Chem,2012;130(2):261-6.

6 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編(下冊)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:788.

7 熊皓平,何國慶,楊偉麗,等.顯齒蛇葡萄生化成分分析〔J〕.中國食品學(xué)報,2004;4(3):68-71.

8 付 明,胡朝暾,周 亮,等.藤茶黃酮含量及其體外抗脂質(zhì)過氧化能力研究〔J〕.食品工業(yè)科技,2013;34(7):146-8,214.

9 廖寅平,王 碩,安豐軒,等.藤茶降血壓作用研究〔J〕.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2013;7(17):229-30.

10 熊皓平,何國慶,楊偉麗,等.顯齒蛇葡萄提取物抗菌作用的研究〔J〕.中國食品學(xué)報,2004;4(1):55-9.

11 鐘正賢,楊秀芬,陳學(xué)芬,等.顯齒蛇葡萄葉總黃酮對苯并芘染毒小鼠血清和肝臟抗氧化酶的影響〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志,2009;30(7):51-3.

12 Huang B,Ban XQ,He JS,etal.Comparative analysis of essential oil components and antioxidant activity of extracts of Nelumbo nucifera from various areas of China〔J〕.J Agric Food Chem,2010;58(11):441-8.

13 Yangthong M,Hutadilok-Towatana N,Phromkunthong W.Antioxidant activities of four edible seaweeds from the southern coast of Thailand〔J〕.Plant Foods Hum Nutr,2009;64(3):218-23.

14 Jagtap UB,Panaskar SN,Bapat VA.Evaluation of antioxidant capacity and phenol content in jackfruit(artocarpusheterophyllus Lam.)fruit pulp〔J〕.Plant Foods Hum Nutr,2010;65(2):99-104.

15 Krentz AJ,Bailey CJ.Oral antidiabetic agents:current role in type 2 diabetes mellitus〔J〕.Drugs,2005;65(65):385-411.

16 Abdel Moneim A,El-Feki M,Slh E.Effect of nigella sativa,fish oil and gliclazide on alloxan diabetic rats 1.Biochemical and histopathological studies〔J〕.J Egyp Ger,1997；23(5):237.

〔2015-07-05修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

張 斌(1980-)，女，講師，主要從事中醫(yī)學(xué)教學(xué)和研究。

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A

1005-9202(2017)02-0321-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.026