羅超元 夏金堂 姜海平

(暨南大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院 華僑醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510627)

縫隙連接蛋白26基因修飾對人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

羅超元 夏金堂 姜海平

(暨南大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院 華僑醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510627)

目的 探討縫隙連接蛋白(Cx)26基因?qū)θ烁咿D(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株(HCCLM3)細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法 采用慢病毒載體(LV)轉(zhuǎn)染法將載體LV-Cx26轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性HCCLM3細(xì)胞為研究組，僅轉(zhuǎn)染空載體LV-NC-Cx26為對照組，未轉(zhuǎn)染的HCCLM3細(xì)胞為空白組。RT-PCR和Western印跡測定轉(zhuǎn)染后Cx26 mRNA和蛋白表達(dá)；劃痕荷載染料傳輸實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞通訊功能；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期并通過CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖、侵襲能力。結(jié)果 研究組Cx26 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組和空白組(P<0.05)。研究組轉(zhuǎn)染慢病毒載體LV-Cx26后的細(xì)胞通訊功能明顯強(qiáng)于對照組、空白組，即劃痕細(xì)胞中的熒光染料可傳遞到相鄰的3～4列細(xì)胞。研究組G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組和空白組，S期細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組和空白組(P<0.05)。M期三組細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CCK-8法檢測顯示，72 h起研究組細(xì)胞增殖速度明顯低于同期對照組和空白組(P<0.05)；對照組和空白組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，研究組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組和空白組(P<0.05)。結(jié)論 轉(zhuǎn)染Cx26基因可有效抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖和侵襲能力，降低惡性生物學(xué)特征，可成為晚期肝癌治療的新思路。

縫隙連接蛋白26；肝癌細(xì)胞；增殖；侵襲

肝臟是終末期惡性腫瘤主要的轉(zhuǎn)移器官，轉(zhuǎn)移性肝癌具有惡性程度高、預(yù)后差的特點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白(Cx)可在胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，對癌癥的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用〔1〕。目前研究表明，在Cx家族中的Cx26異常表達(dá)可能與惡性腫瘤活性關(guān)系最大〔2〕。本次研究采用慢病毒載體(LV)轉(zhuǎn)染法將載體LV-Cx26轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞株(HCCLM3)細(xì)胞，探討Cx26基因修飾對HCCLM3細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 HCCLM3細(xì)胞購于通派(上海)生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT、鏈霉素、青霉素均購于上海浩然生物技術(shù)有限公司；Cx26病毒載體購于長沙愛科博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒Trizol、RT-PCR兩步法試劑盒、cDNA合成試劑盒、DNA Marker均購于上海百研生物科技有限公司；PCR引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司化學(xué)合成；兔抗人Cx26多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國Santa公司；Transwell小室、羅氏黃液、膽囊收縮素-8(CCK-8)均購于博通維德(北京)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Cx26基因修飾 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HCCLM3細(xì)胞，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，以2×103個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種到6孔板中，觀察細(xì)胞融合率>90%時(shí)，以慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本實(shí)驗(yàn)分為三組：轉(zhuǎn)染慢病毒載體LV-Cx26為研究組，空載體LV-NC-Cx26為對照組，未轉(zhuǎn)染的HCCLM3細(xì)胞為空白組。在轉(zhuǎn)染后48 h后采用RT-PCR和Western印跡法分別測定Cx26 mRNA和蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 劃痕荷載染料傳輸實(shí)驗(yàn) 分別取三組細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于顯微鏡下觀察，當(dāng)鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞匯合度達(dá)到100%后棄去培養(yǎng)液，之后再用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每組標(biāo)本加入1 ml 0.05%的羅氏黃液，用無菌手術(shù)刀片在匯合的細(xì)胞上輕劃數(shù)條劃痕，靜置5 min，PBS洗去染液，熒光顯微鏡下觀察、拍照，采用Image pro plus圖像分析軟件測定熒光強(qiáng)度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 分別取三組細(xì)胞，消化離心后調(diào)整濃度為1×109/L，PBS預(yù)冷洗滌3次，70%冰乙醇沉淀細(xì)胞，4℃下保存?zhèn)溆?，PBS洗滌細(xì)胞后調(diào)整濃度為1×109/L，與含50 mg/L RNA酶的Tris-HCl緩沖液共孵育40 min。加入10 μl磺化丙啶(PI)染色液，4℃避光反應(yīng)30 min，1 h內(nèi)放入流式細(xì)胞儀中檢測。

1.2.4 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 取指數(shù)生長期細(xì)胞，以4×103個(gè)/孔濃度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液150 μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，對照采用空白培養(yǎng)液孔。于每孔中加入配好的CCK-8 40 μl，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h，放入酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度值。

1.2.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶3比例配制基質(zhì)膠，取20 μl涂于Transwell小室，孵育2 h，消化細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，上室加入100 μl含5×108個(gè)細(xì)胞的懸液，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，孵育24 h，用無菌棉簽擦去上室中的基質(zhì)膠和殘余細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 三組Cx26 mRNA的表達(dá)情況 研究組條帶明顯增寬，Cx26 mRNA表達(dá)量(1.063±0.129)明顯高于對照組和空白組(0.618±0.065、0.602±0.041)(P<0.05)。見圖1。

2.2 三組Cx26 蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況 研究組Cx26 蛋白表達(dá)條帶明顯增寬，Cx26蛋白表達(dá)量(2.631±0.193)明顯高于對照組和空白組(0.691±0.046、0.673±0.069；P<0.05)。見圖2。

2.3 三組細(xì)胞間連接通訊變化情況 研究組轉(zhuǎn)染LV-Cx26后的細(xì)胞通訊功能明顯強(qiáng)于對照組、空白組，即劃痕細(xì)胞中的熒光染料可傳遞到相鄰的3～4列細(xì)胞。見圖3。

圖1 RT-PCR檢測三組肝癌HCCLM3細(xì)胞中Cx26 mRNA的表達(dá)

圖2 Western印跡檢測三組肝癌HCCLM3細(xì)胞中Cx26蛋白的表達(dá)

圖3 三組肝癌HCCLM3細(xì)胞通訊功能情況(×400)

2.4 三組細(xì)胞周期檢測情況比較 研究組G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組和空白組，S期細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組和空白組(P<0.05)。M期三組細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.5 三組細(xì)胞增殖情況比較 72 h起研究組細(xì)胞增殖速度明顯低于同期對照組和空白組(P<0.05)；對照組和空白組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

2.6 三組細(xì)胞體外侵襲力比較 研究組穿膜細(xì)胞數(shù)(46.72±5.96)明顯少于對照組和空白組(76.36±5.36、77.85±5.69)(P<0.05)，Cx26基因修飾可明顯降低肝癌HCCLM3細(xì)胞的侵襲力。見圖4。

表1 Cx26基因修飾對肝癌HCCLM3細(xì)胞周期的影響±s)

與空白組和對照組比較：1)P<0.05；下表同

表2 各時(shí)間點(diǎn)三組細(xì)胞增殖情況比較±s)

圖4 三組Transwell實(shí)驗(yàn)48 h后結(jié)果(×400)

3 討 論

肝癌多發(fā)于50歲之后的中老年人群，臨床惡性程度很高且預(yù)后極差。研究已發(fā)現(xiàn)，Cx在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞活動(dòng)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用〔3〕。在多數(shù)腫瘤進(jìn)展中，常伴隨Cx表達(dá)下降，恢復(fù)其表達(dá)水平有助于抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)凋亡〔4〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種胃腸道腫瘤中恢復(fù)Cx32表達(dá)可有效降低病灶的轉(zhuǎn)移和侵襲力〔5〕；肝癌細(xì)胞中，過表達(dá)Cx32可恢復(fù)細(xì)胞間隙功能并減弱其侵襲力〔6〕?？梢奀x作為抑癌因素已得到廣泛認(rèn)可。

本研究提示Cx26基因修飾可有效降低高轉(zhuǎn)移性肝癌組織的惡性生物學(xué)行為。但腫瘤的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且處于發(fā)展變化中，因此Cx在腫瘤不同階段的作用可能存在差異。在腫瘤發(fā)展早期，Cx表達(dá)可能起到促進(jìn)病情發(fā)展的作用，但在腫瘤晚期，恢復(fù)或出現(xiàn)Cx可能起到重要的腫瘤抑制因子作用。本次研究中選用的HCCLM3細(xì)胞屬于晚期肝癌細(xì)胞，因此可認(rèn)為Cx基因修飾是抑制晚期肝癌病情進(jìn)展的一個(gè)有效手段。

綜上所述，Cx26基因表達(dá)減少或缺失導(dǎo)致的間隙連接功能喪失在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖方面發(fā)揮明顯作用，同時(shí)可影響HCCLM3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過LV-Cx26轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞可有效降低其惡性生物學(xué)行為，為晚期肝癌的治療提供了新的思路。

1 夏照明.間隙連接蛋白26、32、43在原發(fā)性腎上腺腫瘤的表達(dá)及其臨床意義〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

2 張吉林，常哲興，宋 宇，等.腫瘤患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞TCR Vβ基因克隆化分析〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015；16(5)：593-6.

3 Drygin D，Lin A，Bliesath J，etal.Targeting RNA polymerase I with an oral small molecule CX-5461 inhibits ribosomal RNA synthesis and solid tumor growth.〔J〕.Cancer Res，2011；71(4)：1418-30.

4 韓 濤.Shp2調(diào)控肝癌進(jìn)展的信號網(wǎng)絡(luò)及臨床意義研究〔D〕.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2013.

5 Watanabe E，Buchman TG，Hirasawa H.Association between lymphotoxin-α(tumor necrosis factor-β) intron polymorphism and predisposition to severe sepsis is modified by gender and age〔J〕.Crit Care Med，2010；38(1)：181-93.

6 Zhang J，Grindstaff RD，Thai SFetal.Chloral hydrate decreases gap junction communication in rat liver epithelial cells〔J〕.Cell Biol Toxic，2011；27(3)：207-16.

〔2016-10-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東省科學(xué)技術(shù)廳計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016ZC0142)

姜海平(1960-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事普通外科研究。

羅超元(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事普通外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0284-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.011