王建明 回陳紅 劉昊坤 杜云帆 秦瑄希 牛嗣云

(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，河北 保定 071000)

何首烏飲對(duì)衰老大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響

王建明1回陳紅 劉昊坤2杜云帆2秦瑄希2牛嗣云

(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，河北 保定 071000)

目的 探討何首烏飲對(duì)衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響。方法 選用18月齡Wistar大鼠為自然衰老動(dòng)物模型，以12月齡大鼠作為青年對(duì)照，采用原位末端標(biāo)記法和流氏細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)何首烏飲灌胃用藥60 d和30 d的18月齡大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡率變化和DNA含量的變化。結(jié)果 與青年對(duì)照組相比，自然衰老組睪丸細(xì)胞凋亡率明顯增高，單倍體和4倍體細(xì)胞明顯減少并以二倍體為主，G1/G0期細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低(P<0.05)；而何首烏飲用藥后與自然衰老組相比，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；4倍體和單倍體比例明顯增加(P<0.05)，與青年對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；細(xì)胞增殖指數(shù)明顯升高(P<0.05)，G1/G0期細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 何首烏飲可以抑制生精細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，達(dá)到延緩睪丸組織衰老的效果，但其具體作用機(jī)制有待研究。

何首烏飲；睪丸組織；細(xì)胞凋亡；衰老

細(xì)胞凋亡在清除發(fā)生異常的生精細(xì)胞，調(diào)節(jié)精子的數(shù)量和質(zhì)量方面具有重要作用〔1〕。隨著增齡，睪丸組織生精細(xì)胞過(guò)度凋亡，使精子數(shù)量明顯減少，異常精子數(shù)明顯增多〔2〕，其中精原細(xì)胞特別是A型精原細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致精子異常的主要原因〔3〕。目前，關(guān)于何首烏飲對(duì)睪丸組織細(xì)胞凋亡研究報(bào)道較少，本研究觀察何首烏飲對(duì)自然衰老大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 何首烏飲(SWY)方劑(河北省中醫(yī)院)，原位末端標(biāo)記試劑盒(羅氏，美國(guó)),細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和FACS420 型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，美國(guó))，激光共聚焦顯微鏡(Olympus IX81，日本)，冰凍切片機(jī)(Leica，德國(guó))，Eppendorf5424型離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，-80℃冰箱(Thermo，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和取材 選用12月齡的Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為青年對(duì)照組(YC組)、自然衰老組(NA組，灌胃等量的蒸餾水)、SWY1組和SWY2組，每組15只。分別在飼養(yǎng)到16、17月齡后，采用何首烏飲(4.8 g/100 g)，灌胃60 d(SWY1組)、30 d(SWY2組)。去除患腫瘤等疾病的大鼠，最終每組取10只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析。大鼠斷頭處死，取一側(cè)睪丸用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水后，-80℃保存，用于制備冰凍切片；另一側(cè)睪丸組織先放液氮中，幾分鐘后再放入-80℃保存，用于進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.2 中藥復(fù)方劑的配制 SWY方劑：由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓剪碎按質(zhì)量比3∶2∶3∶2∶5∶3剪碎混合，加8倍量蒸餾水浸泡1 h，然后文火水煎2次，每次30 min，過(guò)濾后濃縮至含生藥分別為4.8 g/ml，4℃ 保存，給藥前復(fù)溫至25℃～30℃。給藥量：按照成人劑量換算，SWY熬制后含生藥2.4 g/100 g相當(dāng)于成人用藥量，根據(jù)前期研究結(jié)果選用成人量2倍療效最佳，因而采用含生藥4.8 g/100 g作為給藥濃度。0.4 ml/100 g灌胃，每天15∶00灌胃1次，連續(xù)灌胃60 d或30 d。

1.2.3 原位末端標(biāo)記法檢測(cè)睪丸組織細(xì)胞凋亡率 冰凍切片平衡至室溫，PBS洗滌3次，每次10 min；0.5% TritonX-100室溫通透20 min；PBS洗滌3次，每次10 min；每個(gè)切片加約30 μl Equilibration Buffer室溫反應(yīng)10 min；加入染色工作液，37℃避光孵育1 h；加入2倍SCC室溫反應(yīng)15 min；PBS洗滌3次，每次10 min；DAPI室溫染核20 min,PBS洗滌3次，每次10 min；待片子晾干后用專用熒光封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。每組選取3只大鼠的一側(cè)睪丸組織進(jìn)行切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求得陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生精細(xì)胞中DNA含量 取冰凍組織適量，42℃復(fù)溫，去除白膜和脂肪墊，放于培養(yǎng)皿中。向培養(yǎng)皿加入1 ml PBS，用剪刀剪碎，將懸液轉(zhuǎn)入組織破碎儀的加樣槽內(nèi)破碎1 min。用5 ml注射器從吸樣孔內(nèi)吸出細(xì)胞懸液，4 000 r/min離心10 min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入1 ml 70%冰乙醇，用移液槍輕輕吹打混勻，4℃固定過(guò)夜。取出細(xì)胞懸液，4 000 r/min，離心8 min，棄乙醇上清；加入1 ml PBS重懸，4 000 r/min，離心8 min，棄上清，重復(fù)2次。向沉淀中加入500 μl PI染色液，4℃下放置30 min，過(guò)200目濾網(wǎng)。應(yīng)用FACS420 型流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，數(shù)據(jù)輸入Consort-30計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。細(xì)胞的增殖活性以增殖指數(shù)(PI)表示,其計(jì)算公式為:PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+S2/M)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均數(shù)比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)，如果方差不齊則采用DunnettT3檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 何首烏飲對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 YC組大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡較少見(jiàn)，主要分布在間質(zhì)細(xì)胞。NA組大鼠睪丸組織生精小管內(nèi)可見(jiàn)大量凋亡的生精細(xì)胞且凋亡陽(yáng)性信號(hào)主要分布于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，偶見(jiàn)于間質(zhì)細(xì)胞。SWY組大鼠的睪丸組織凋亡細(xì)胞明顯減少，可見(jiàn)部分精原細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡。半定量分析顯示，NA組大鼠細(xì)胞凋亡率〔(14.606 7±0.092 8)%〕明顯高于YC組〔(1.946 7±0.440 1)%〕(P<0.01)；SWY組細(xì)胞凋亡率明顯低于NA組(P<0.01),且SWY1組細(xì)胞凋亡率〔(8.008 9±0.164 3)%〕明顯低于SWY2組〔(12.959 3±0.317 4)%〕。見(jiàn)圖1。

2.2 何首烏飲對(duì)生精細(xì)胞周期的影響 圖2所見(jiàn)，YC組睪丸生精細(xì)胞以單倍體為主，包括圓形精子以及精子；NA組單倍體和4倍體細(xì)胞明顯減少，以二倍體為主；與NA組相比，SWY飲組4倍體和單倍體比例明顯增加(P<0.05)，且與YC組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與YC組相比，NA組可引起G1/G0期細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，PI明顯降低(P<0.05)；SWY用藥后，PI明顯升高(P<0.05)，G1/G0期細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，且SWY1組PI明顯高于SWY 2組。見(jiàn)表2。

圖1 SWY對(duì)各組睪丸細(xì)胞凋亡的影響

圖2 SWY對(duì)大鼠睪丸組織各種倍體細(xì)胞所占百分比的影響

組別G1/G0(%)S(%)G2/M(%)PIYC組5064±3422772±3621901±3845205±342NA組8102±4471)892±1471)1006±3361)1898±4471)SWY組6265±1792)1966±5132)1748±4652)3733±1792)

與YC組比較：1)P<0.05；與NA組比較：2)P<0.05

3 討 論

現(xiàn)代研究證實(shí)，何首烏具有提高機(jī)體免疫力，降血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)保護(hù)作用，具有明顯的抗衰老效果〔4〕。何首烏丸是劉河間《宣明論》的傳統(tǒng)臨床驗(yàn)方，以何首烏為主藥，配以肉蓯蓉和懷牛膝臨床療效可靠。SWY是由何首烏丸加味而成，其中淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)以強(qiáng)筋骨，丹參活血化瘀以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神。目前研究結(jié)果表明，SWY能提高D-半乳糖所致衰老大鼠的抗氧化能力、改善血脂紊亂狀態(tài)，調(diào)節(jié)性腺細(xì)胞衰老通路 p53/pRb 相關(guān)蛋白表達(dá)〔5,6〕。我們前期研究發(fā)現(xiàn)SWY飲能夠提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成酶表達(dá)，促進(jìn)睪酮的分泌，提高自然衰老大鼠精子質(zhì)量〔7〕。SWY可以上調(diào)過(guò)度訓(xùn)練大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的 Bcl-2 蛋白表達(dá)，下調(diào) Bax 蛋白表達(dá)，從而抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，減輕過(guò)度訓(xùn)練對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損傷〔8〕。

衰老將導(dǎo)致雄性哺乳動(dòng)物精子生成能力減弱，生精細(xì)胞凋亡增加〔2〕，隨著年齡增加，老年小鼠睪丸中部分曲精細(xì)管萎縮、基膜增厚，生精阻滯常見(jiàn)于初級(jí)精母細(xì)胞或精子細(xì)胞階段〔9〕；減少最明顯的就是球形精子或延長(zhǎng)精子細(xì)胞〔10〕，這說(shuō)明衰老小鼠生精功能改變最先發(fā)生在精子發(fā)生的后期。Syed 等〔11〕指出老年小鼠支持細(xì)胞誘導(dǎo)能力的丟失也是導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡的重要原因。細(xì)胞凋亡由多位點(diǎn)調(diào)控，可以發(fā)生在細(xì)胞周期的各個(gè)階段，常見(jiàn)的有G0/G1期停滯和G2/M期阻滯〔12～14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SWY能明顯降低自然衰老大鼠睪丸細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞增殖指數(shù)，證明SWY能抑制衰老大鼠生精細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，但此種作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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〔2016-10-25修回〕

(編輯 郭 菁)

The effects of Heshouwuyin on germ cell apoptosis in natural aging rats

WANG Jian-Ming,HUI Chen-Hong,LIU Hao-Kun,etal.

Department of Tissue and Embryo,School of Medicine,Hebei University,Baoding 071000,Hebei,China

Objective To investigate the effects of Heshouwuyin on testicular germ cells apoptosis in natural aging rats.Methods 18-month-old Wistar rats were served as a model of natural aging and 12-month-old rats were as a young control group.Heshouwuyin group 1 and group 2 were given Heshouwuyin intragastrically for 60 days and 30 days respectively.In situ end labeling and flow cytometry methods were selected to detect the rate of apoptosis detection and the amount of DNA in testicular cells.Results The rate of testicular cell apoptosis was obviously higher in natural aging group and that intervention with Heshouwuyin reversed this phenomenon(P<0.05).The spermatogenic cells in natural aging group were mainly diploid and the numbers of haploid and tetraploid were significantly lower,but the rate of haploid and tetraploid was significantly higher in Heshouwuyin group than that in nature aging group(P<0.05).Compared with that of young control group，the number of cells in G1/G0cycle arrest was significantly higher in natural aging group (P<0.05),and the cell proliferation index was significantly lower in natural aging group (P<0.05).Heshouwuyin administration reversed this phenomenon.Conclusions Heshouwuyin could inhibit testicular cells apoptosis,promote cell proliferation,reach the effects of anti-aging,but its mechanism of action remains to be further researched.

Heshouwuyin; Testis tissue; Cell apoptosis; Aging

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373787)；河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H2013201139)

牛嗣云(1967-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事生殖藥理學(xué)的研究。

王建明(1969-)，男，副教授，主要從事生殖藥理學(xué)的研究。

R34

A

1005-9202(2017)02-0266-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.003

1 河北民族師范學(xué)院 2 中國(guó)人民解放軍軍事交通學(xué)院九連