王書平, 蘇翠翠, 朱雅君, 張 凱, 朱 堅, 葉 軍

(1. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 南京 210095; 3. 上海共青森林公園, 上海 200438)

表皮碳氫化合物在云杉大墨天牛和云杉小墨天牛鑒定中的應用

王書平1*, 蘇翠翠2, 朱雅君1, 張 凱3, 朱 堅1, 葉 軍1

(1. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 南京 210095; 3. 上海共青森林公園, 上海 200438)

云杉大墨天牛和云杉小墨天牛是進境木材及木質(zhì)包裝中常見的檢疫性害蟲,由于墨天牛屬近緣種之間的幼蟲形態(tài)相似,形態(tài)鑒定資料不完整,對低齡幼蟲的鑒定尤其困難。為了鑒定云杉大墨天牛和云杉小墨天牛,本文利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲的表皮碳氫化合物進行了分析,經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫檢索,并與標準圖譜比較,應用色譜峰面積歸一法測定各組分及其相對含量。結(jié)果表明,云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲表皮中的主要碳氫化合物由C24～C44的直鏈或支鏈、飽和及不飽和的長鏈烴類組成。云杉大墨天牛幼蟲表皮有9種碳氫化合物,而云杉小墨天牛幼蟲表皮有8種碳氫化合物,其中6種碳氫化合物為兩種昆蟲共有,但在含量上有差異。云杉大墨天牛特有的成分為正二十四烷、正三十六烷、正四十四烷,而云杉小墨天牛特有的成分為2-甲基-二十六烷、9-二十六碳烯。這些特有表皮碳氫化合物可用于近緣種云杉大墨天牛和云杉小墨天牛的分類鑒定。

云杉大墨天牛; 云杉小墨天牛; 表皮碳氫化合物; 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

云杉大墨天牛Monochamusurussovi和云杉小墨天牛M.sutor屬于鞘翅目Coleoptera,天?？艭erambycidae,墨天牛屬Monochamus。墨天牛屬廣泛分布于北美洲、歐洲大部、非洲北部以及亞洲東部等[1]。墨天牛屬的多數(shù)種類是為害松、杉、柳、檜柏、櫟等林木的重要害蟲,其中有不少種類是林木病原微生物的媒介昆蟲,給林業(yè)生產(chǎn)帶來毀滅性災害[1-2]。云杉大墨天牛和云杉小墨天牛是我國進境木材及木質(zhì)包裝中主要的天?？坪οx,墨天牛屬非中國種被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。截獲的云杉大墨天牛和云杉小墨天牛大部分為幼蟲狀態(tài)。但由于云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲形態(tài)相似,特征區(qū)分不明顯,加之形態(tài)鑒定資料不全,給這兩種天牛低齡幼蟲的鑒定帶來了很大困難。

昆蟲表皮碳氫化合物是昆蟲表皮蠟質(zhì)層的主要成分,是碳原子數(shù)為20～50的直鏈或支鏈、飽和及不飽和的長鏈烴類,蠟層和護蠟層經(jīng)過多元酚鞣化作用后,性質(zhì)相當穩(wěn)定[3-4]。Hoppe 等比較了3個虻屬Tabanus害蟲在形態(tài)和地理分布上相似的種表皮碳氫化合物,發(fā)現(xiàn)種間差異顯著[5]。Harverty等對原白蟻屬Zootermopsis群體(包括各個等級)的表皮碳氫化合物進行分析測定,得到了63 個組分。根據(jù)各組分的有無、含量及統(tǒng)計分析結(jié)果,將原白蟻屬群體分為4個獨特的碳氫化合物表現(xiàn)型,并對該屬現(xiàn)存3個種的劃分提出質(zhì)疑,根據(jù)表皮碳氫化合物的種特異性,鑒定出原白蟻屬的一個新種[6]。Golebiowski等人分別對絲光綠蠅Luciliasericata幼蟲、蛹、雌成蟲和雄成蟲的表皮碳氫化合物進行了研究,發(fā)現(xiàn)在這4種蟲態(tài)中,均以大量的C27和 C29的正烷烴成分為主,其中幼蟲和蛹期以C29為主,含量分別為42.1%和59.5%,成蟲期以C27為主,含量分別為雌成蟲47.5%,雄成蟲47.9%[7]。崔可倫等利用表皮碳氫化合物對淡色庫蚊Culexpipienspallens和致倦庫蚊C.pipiensquinquefasciatus進行了鑒別,分析了海南省不同地區(qū)不同季節(jié)大劣按蚊Anophelesdirus的表皮碳氫化合物,表明其為同一個種[8-9]。趙成銀等對西花薊馬Frankliniellaoccidentalis成蟲和若蟲的表皮碳氫化合物主要成分進行了分析,認為西花薊馬成蟲和若蟲表皮中的主要成分為C25～C29的支鏈和直鏈飽和烷烴,成蟲和若蟲表皮中分別檢測到9種和8種碳氫化合物,9-甲基二十五烷為成蟲特有,其他8種碳氫化合物為成、若蟲共有[10]。

目前,對云杉大墨天牛和云杉小墨天牛表皮碳氫化合物的研究尚未見報道。本文對云杉大墨天牛和云杉小墨天牛表皮碳氫化合物組分進行分析,探索表皮碳氫化合物在墨天牛屬幼蟲分類鑒定工作中的實際應用意義,積極尋找準確快速的幼蟲分類鑒定技術(shù),從生化水平上對昆蟲分類研究提供理論依據(jù),為云杉大墨天牛和云杉小墨天牛的種類快速鑒別及其檢疫監(jiān)測提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

供試墨天牛幼蟲為5齡幼蟲,從來自烏克蘭的進境木材中發(fā)現(xiàn),經(jīng)形態(tài)分類鑒定,確定為云杉大墨天牛和云杉小墨天牛。

1.2 儀器與試劑

儀器:氣相色譜(安捷倫-7890A)與質(zhì)譜(安捷倫 5975C)聯(lián)用儀;凍干機(LABCONCO);氮吹儀(HGC-12A)

試劑:正己烷(國藥集團化學試劑有限公司)

1.3 儀器分析條件

色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm)(美國Agilent公司),進樣口溫度為280℃,不分流,色譜柱的起始溫度80℃保留1 min,以5℃/min升至200℃,保留2 min,再以10℃/min升至300℃,保留10 min。載氣為高純度氮氣,柱壓為9.38 psi。采用直接進樣的方式,進樣體積為1 μL,GC流速為1 mL/min。質(zhì)譜參數(shù)為:四級桿溫度為150℃;離子源溫度為230℃;掃描速度:每秒5張質(zhì)譜圖。

1.4 樣品制備方法

將墨天牛幼蟲置于清水中用毛筆清除其表面的雜質(zhì)、糞便等,隨后置于干凈的紙上晾干。將晾干的墨天牛幼蟲放入干凈的EP管內(nèi),在-30℃冰箱內(nèi)預凍存24 h，然后放入凍干機內(nèi)進行凍干,凍干條件為冷阱溫度-40℃,真空度0.01 mbar以下,凍干時間為24 h。將凍干的墨天牛幼蟲放入10 mL EP管內(nèi),加入5 mL正己烷萃取20 min,吸取上清液至另一個干凈的EP管內(nèi),使用氮吹儀濃縮上清液至500 μL。將濃縮后的上清液移至色譜瓶中備用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

定性分析：將由氣相色譜分離得到的各組分通過質(zhì)譜儀進行鑒定,組分鑒定分析主要根據(jù)各化合物的質(zhì)譜圖所得離子峰信息,首先推斷各組分分子量,再按照分子裂分的一般規(guī)律及質(zhì)譜解析程序做初步分析,最后與EPA/NzHMas、Spectral Data標準圖譜庫中的標準圖譜對照確定每個組分的結(jié)構(gòu)式。

定量分析：應用氣相色譜儀分析墨天牛表皮碳氫化合物,根據(jù)供試蟲體的總離子流色譜圖,分別對每一組分峰的面積積分,獲得相應的各組分峰的面積,(在試驗條件恒定時,峰面積或峰高與組分的含量成正比)。根據(jù)各組分峰的峰面積,按比例求出其組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析總離子流圖

對墨天牛幼蟲表皮碳氫化合物經(jīng)GC-MS分析,獲得云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲表皮碳氫化合物的總離子流色譜圖(圖1),GC-MS分析共檢測到11種碳氫化合物,其中云杉大墨天牛幼蟲表皮中檢測到9種碳氫化合物,云杉小墨天牛幼蟲表皮中檢測到8種碳氫化合物。

圖1 云杉大墨天牛(a)和云杉小墨天牛(b)幼蟲表皮碳氫化合物總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Monochamus urussovi (a) and M.sutor (b) of the cuticular hydrocarbons

2.2 墨天牛表皮碳氫化合物組分及含量分析

經(jīng)GC-MS分析和NIST譜庫系統(tǒng)檢索并與標準圖譜比較,獲得墨天牛幼蟲表皮碳氫化合物的名稱和相對含量。云杉大墨天牛幼蟲表皮有9種碳氫化合物(表1),包括正二十四烷、正二十五烷、3-乙基-二十四烷、正二十七烷、正三十四烷、三十碳六烯、正二十九烷、正三十六烷、正四十四烷;其中正二十五烷含量較高,為54.51%,其次為正二十七烷,含量為27.16%,正四十四烷含量最低,相對含量為0.51%。云杉小墨天牛幼蟲表皮有8種碳氫化合物(表2),包括2-甲基-二十六烷、正二十五烷、3-乙基-二十四烷、9-二十六碳烯、正二十七烷、正三十四烷、三十碳六烯、正二十九烷;其中正二十五烷含量較高,為55.70%,其次為正二十七烷,含量為24.96%,2-甲基-二十六烷含量最低,相對含量為1.11%。

根據(jù)試驗結(jié)果可知,墨天牛的11種碳氫化合物主要是由直鏈和支鏈的飽和烷烴和烯烴組成,云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲有6種共有的碳氫化合物,占97%～98%。其共有物質(zhì)的豐度,云杉大墨天牛都高于云杉小墨天牛,其中云杉大墨天牛中特有的成分為正二十四烷、正三十六烷、正四十四烷。其中云杉小墨天牛中特有的成分為2-甲基-二十六烷和9-二十六碳烯。

表1 云杉大墨天牛幼蟲表皮碳氫化合物

Table 1 Cuticular hydrocarbons ofMonochamusurussovilarvae

序號No.保留時間/minRetentiontime特征離子m/zofcharacteristicions碳氫化合物Hydrocarbon峰高Peakheight相對含量/%Relativecontent110.644M+338正二十四烷n-tetracosane146090.79212.091M+352正二十五烷n-pentacosane96810654.51313.102-3-乙基-二十四烷3-ethyl-tetracosane990315.05414.882M+380正二十七烷n-heptacosane64138427.16515.884M+478正三十四烷n-tetratriacontane1393065.45616.679-三十碳六烯Squalene435541.70717.69M+408正二十九烷n-nonacosane903344.22818.53M+506正三十六烷n-hexatriacontane191280.62920.119M+618正四十四烷n-tetratetracontane135950.51

表2 云杉小墨天牛幼蟲表皮碳氫化合物

Table 2 Cuticular hydrocarbons ofMonochamussutorlarvae

序號No.保留時間/minRetentiontime特征離子m/zofcharacteristicions碳氫化合物Hydrocarbon峰高Peakheight相對含量/%Relativecontent110.651-2-甲基-二十六烷2-methylhexacosane92271.11212.072M+352正二十五烷n-pentacosane50559555.70313.102-3-乙基-二十四烷3-ethyl-tetracosane433604.53414.657-9-二十六碳烯9-hexacosene194101.78514.872M+380正二十七烷n-heptacosane29365224.96615.872M+478正三十四烷n-tetratriacontane550764.63716.673-三十碳六烯Squalene400953.20817.564M+408正二十九烷n-nonacosane537344.08

3 討論

1969年，Moore首先報道了澳大利亞澳洲土垅白蟻Nasutitermesexitiosus表皮烴的組成，發(fā)現(xiàn)其主要為24～27碳的直鏈烴，且以奇數(shù)碳為主[11]。Golden等通過表皮碳氫化合物對螢葉甲科的兩個近緣種Diabroticalongicornis與D.barberi進行了分析[12]。Anyanwu和Carlson等根據(jù)表皮碳氫化合物中二十六碳烷、1，3，2-三甲基三十一碳烷和二甲基三十九碳烷的相對豐度差異，將岡比亞按蚊復合體Anophelesgambiae中兩個形態(tài)上無法辨別的近緣種A.gambiae和A.arabiensis進行了區(qū)分[13-14]。日本學者Takematsu對4種樹白蟻Glyptotermes的研究表明，黑樹白蟻G.fuscus、赤樹白蟻G.satsumensis和G.nakajimai的表皮碳氫化合物組成各異，而G.kushimensis的表皮碳氫化合物組成與G.nakajimai相同。因此認為G.kushimensis與G.nakajimai應為同一種，即存在同物異名現(xiàn)象[15]。Carlson和Walsh分析了蚋Simuliumdamnosum復合體中的2個種，通過對表皮碳氫化合物組分進行分析，成功地將復合體中兩個種鑒定出來[16]。

國內(nèi)對昆蟲表皮碳氫化合物的研究較少。趙彤言等應用毛細管氣譜法對我國尖音庫蚊復合組尖音庫蚊、淡色庫蚊和致倦庫蚊的表皮碳氫化合物進行了分析，并與該復合組分布于日本的騷擾庫蚊以及親緣種迷走庫蚊進行了比較。結(jié)果表明，尖音庫蚊復合組各成員碳氫化合物的主要組分相同，含量略有差異，與迷走庫蚊相比則有顯著差異，表現(xiàn)出了復合組的特征[17]。高明媛等研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲與煙青蟲幼蟲表皮碳氫化合物的組分與含量均有顯著差異[18]。梁曉松等利用固相萃取技術(shù)對臺灣白蟻表皮碳氫化合物進行萃取，分析發(fā)現(xiàn)白蟻表皮中含有24種碳氫化合物，主要為11，13-二甲基二十六烷烴(33.34%)和2,4,6-三甲基二十七烷烴(15.75%)[19]。

近緣種云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲形態(tài)上十分相似，很難鑒定。通過GC-MS分析結(jié)果表明，云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲都含有6種相同的碳氫化合物，但它們也含有自己特有的碳氫化合物。這些特有的碳氫化合物可用于鑒定云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲，這為今后墨天牛的檢疫鑒定提供了有用的數(shù)據(jù)支持。云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲表皮碳氫化合物成分與相對含量的差異，其原因有待進一步深入研究。利用表皮碳氫化合物區(qū)分云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼蟲可以大大縮短口岸檢疫的時間，且成本低，操作簡單，不受實驗樣品的限制，干燥標本、新鮮標本或冷凍標本都可以進行分析，克服了分子鑒定方法對活體樣品的特殊要求，并且整體浸泡的提取方法不損壞昆蟲的外部形態(tài)，可以繼續(xù)保存標本，以備將來進一步研究，在口岸檢疫中有較高的實用價值。

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(責任編輯:楊明麗)

Identification ofMonochamusurussoviandMonochamussutorby using cuticular hydrocarbons

Wang Shuping1, Su Cuicui2, Zhu Yajun1, Zhang Kai3, Zhu Jian1, Ye Jun1

(1.TechnicalCenterforAnimalPlantandFoodInspectionandQuarantine,ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China; 2.CollegeofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 3.ShanghaiGongqingForestPark,Shanghai200438,China)

Monochamusspp. are important quarantine pests, which can be found in imported wood and wood packages. The cuticular hydrocarbons from the cuticle ofMonochamusurussoviandM.sutorwere analyzed by gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS) without solvent. The composition of the cuticular hydrocarbons was then determined by the area normalizing method. By searching the NIST database and comparison with standard mass spectra, nine constituents were identified in the cuticular hydrocarbons ofM.urussovi, and eight in those ofM.sutor. The principal components ofM.urussoviandM.sutorcuticular hydrocarbons were straight and branched-chain, saturated and unsaturated long-chain hydrocarbons ranging from C24to C44. Similar hydrocarbon patterns were found inM.urussoviandM.sutorand six constituents were found in both pests but with differences in quantity.n-tetracosane,n-hexatriacontane andn-tetratetracontane were detected only inM.urussovi, whereas 2-methylhexacosane and 9-hexacosene were found only inM.sutor.

Monochamusurussovi;Monochamussutor; cuticular hydrocarbon; GC-MS

2016-01-27

2016-02-08

上海出入境檢疫檢疫局課題(HK006-2014)

S 763

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.019

* 通信作者 E-mail: wangsp@shciq.gov.cn