趙文靜，張春林，陳漢彬，張　晶，劉　彬

(貴州醫(yī)科大學生物學教研室,貴陽 550004)

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基于CO I與ITS序列的雜鱗庫蚊復組(雙翅目：蚊科)分子系統(tǒng)發(fā)育

趙文靜，張春林*，陳漢彬，張晶，劉彬

(貴州醫(yī)科大學生物學教研室,貴陽 550004)

使用雜鱗庫蚊復組CO I部分序列和ITS序列構建分子發(fā)育樹，并基于CO I序列計算該復組種內和種間的Kimura-two-Parameter (K2P)距離，探討環(huán)帶庫蚊的分類地位和雜鱗庫蚊復組內各親緣種的系統(tǒng)發(fā)育關系。環(huán)帶庫蚊和雜鱗庫蚊的種間K2P距離為0.24%-0.72%，支持“環(huán)帶庫蚊是雜鱗庫蚊的同物異名”這一觀點；雜鱗庫蚊(環(huán)帶庫蚊)和偽雜鱗庫蚊、三帶喙庫蚊的種間K2P距離為4.41%-9.68%，同時分子系統(tǒng)樹顯示各個種分別聚類，互為姐妹群，再次證明三者互為獨立的種；環(huán)帶庫蚊和雜鱗庫蚊聚類的分支最接近樹的端部，三帶喙庫蚊分支最接近樹的基部，提示三帶喙庫蚊最早發(fā)生分化，而雜鱗庫蚊(環(huán)帶庫蚊)最晚發(fā)生分化；采集自日本的三帶喙庫蚊種內K2P距離為0.48%-2.68%，而它們與采集自中國、印度的該種K2P距離為4.17%-6.76%，日本產三帶喙庫蚊聚集成一支，并與中印產地的聚類分支互為姐妹群，這些結果提示日本的三帶喙庫蚊有種下，甚至種級分化的趨勢。

雜鱗庫蚊復組；核酸序列；K2P距離；分子系統(tǒng)發(fā)育

雜鱗庫蚊復組Culexvishnuicomplex隸屬于庫蚊屬海濱庫蚊組Culexsitiensgroup，主要分布于東洋界，并向古北界延伸。目前記載有4個種：環(huán)帶庫蚊C.annulusTheobald, 1901，雜鱗庫蚊C.vishnuiTheobald, 1901，偽雜鱗庫蚊C.pseudovishnuiColless, 1957和三帶喙庫蚊C.tritaeniorhynchusGiles, 1901。其共同特征是：陽莖側板內葉(復支)密生小刺；中葉分4-5個指環(huán)突；外葉的背、腹齒約等大；載肛突基內側有側楔；喙和跗有淡色環(huán)。其中三帶喙庫蚊已經被多次證實是日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)的主要傳病媒介。該復組與醫(yī)學關系密切，因此自報道以來，便引起國內外學者的關注。但是由于雜鱗庫蚊復組的各親緣種在形態(tài)上較相近，各個種的變異幅度較大，所以它的分類歷史上一直存在著不同的觀點和鑒定困難。譬如環(huán)帶庫蚊在頭頂正中的豎鱗顏色、翅長、幼蟲頭毛1-C等均有不同程度的變異，因此在對其變異規(guī)律未加研究的情況下，很可能把種內居群或個體誤定為新種——謝麟閣和廖定西(1956)報告的混同庫蚊CulexpermixtusHsieh & Liao, 1956就屬于這種情況。我國雜鱗庫蚊復組曾報告過7個種和1個亞種，分類比較混亂，后經陳漢彬(1980)進行系統(tǒng)整理和澄清，認為雜鱗庫蚊復組在我國境內只有3種，即環(huán)帶庫蚊、偽雜鱗庫蚊和三帶喙庫蚊。不過遇到形態(tài)變異較大的情況，仍然不易于分辨。另外，對于“環(huán)帶庫蚊是雜鱗庫蚊的同物異名”這一說法，一直存在著爭議。自Theobald(1901)對環(huán)帶庫蚊描述后， Colless(1957)、Bram(1967)、Reuben(1969)、Miyagi和Iha(1970)、Sirivanakarn(1975，1976) 、陳漢彬(1980)先后從形態(tài)學上對其再描述，但沒有達成統(tǒng)一意見。例如，Reuben(1969)根據印度馬德拉斯(雜鱗庫蚊的模式標本產地)標本，認為雜鱗庫蚊和環(huán)帶庫蚊的幼蟲沒有差別，建議將環(huán)帶庫蚊作為雜鱗庫蚊的同物異名處理。隨后Sirivanakarn (1975)也基于同樣理由建議把環(huán)帶庫蚊作為雜鱗庫蚊的亞種或地理型。然而陳漢彬(1980)認為，幼蟲的同一性并不能排除成蟲的差異性，雜鱗庫蚊成蟲喙、翅和腿上具濃密的淡鱗麻點是它與環(huán)帶庫蚊的重要鑒別特征，因此建議將“環(huán)帶庫蚊是雜鱗庫蚊的同物異名”這一說法做存疑處理，在我國繼續(xù)沿用環(huán)帶庫蚊這一名稱。

自核酸序列被廣泛應用于蚊科的系統(tǒng)發(fā)育研究以來，其呈現(xiàn)的分子多態(tài)性和構建的分子樹，成為分類學研究的有力依據，同時也為鑒別雜鱗庫蚊復組的近緣種提供了便利。例如Dhananjeyan等 (2010)提取并擴增印度地區(qū)雜鱗庫蚊、偽雜鱗庫蚊和三帶喙庫蚊的蟲卵、幼蟲和成蟲的ITS 2序列，根據它們的ITS 2凝膠電泳條帶位置差異，實現(xiàn)簡單、快速的種間鑒別。Kumar等(2007)測定印度地區(qū)蚊類22個種的mtDNA CO I序列，構建NJ樹，這種方法成功鑒別出絕大部分蚊類，包括雜鱗庫蚊、偽雜鱗庫蚊和三帶喙庫蚊。Toma等(2000)利用PCR法擴增雜鱗庫蚊、偽雜鱗庫蚊、三帶喙庫蚊等蚊類的ITS 1-5.8S-ITS 2序列，有效的鑒別出雜鱗庫蚊的這3個近緣種。Miller等(1996)測定14種庫蚊(其中包含三帶喙庫蚊和偽雜鱗庫蚊)的ITS序列，并基于此構建分子樹，能夠區(qū)分出三帶喙庫蚊和偽雜鱗庫蚊。遺憾的是，這些文獻都缺乏環(huán)帶庫蚊的樣本，不能夠解決“環(huán)帶庫蚊是否為雜鱗庫蚊的同物異名”這一關鍵問題。反之，涉及到環(huán)帶庫蚊的分子系統(tǒng)發(fā)育研究又缺乏雜鱗庫蚊的樣本。例如楊明等(2003)利用RAPD-PCR技術獲得環(huán)帶庫蚊、偽雜鱗庫蚊和三帶喙庫蚊ITS 2序列，根據它們的長度和數(shù)量成功鑒別出三者。

隨著生物信息公共數(shù)據庫的推廣和應用，利用互聯(lián)網整合現(xiàn)有資源并進行二次分析的做法，既可以克服人力物力缺乏帶來的標本采集困難，又可以避免重復性實驗，能夠利用更廣泛的數(shù)據獲得更全面的結論。鑒于此，本研究從GenBank數(shù)據庫中收集大部分雜鱗庫蚊復組mtDNA CO I和ITS序列，并基于這些序列進行分子系統(tǒng)發(fā)育研究，討論雜鱗庫蚊復組內各親緣種的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關系。另外，由于公共數(shù)據庫缺乏環(huán)帶庫蚊相關序列，所以進行補充測定。

1　材料與方法

1.1環(huán)帶庫蚊mtCO I序列，rDNA ITS序列的獲取

GenBank數(shù)據庫缺乏環(huán)帶庫蚊CO I序列和ITS 1 序列，所以根據現(xiàn)有雜鱗庫蚊復組序列的長度和覆蓋區(qū)域，進行補充測定。數(shù)據庫中的CO I序列均為部分序列，本文設計擴增的環(huán)帶庫蚊CO I片段完全覆蓋并遠遠大于數(shù)據庫中被使用的最短序列。另外由于含ITS 1的序列均以“18S部分序-ITS 1-5.8S-ITS 2-28S部分序列”的形式存在，為獲得同一個樣本的ITS序列(包含ITS 1和ITS 2序列)，進行同樣區(qū)域的擴增。

環(huán)帶庫蚊于2010年8-9月和2013年7月，自貴陽三江農場稻田內采集到幼蟲，經羽化、鑒定后，置無水乙醇，-20℃保存。采用常規(guī)酚-氯仿法提取環(huán)帶庫蚊4齡幼蟲線粒體DNA，并調整濃度為50 ng/mL。

PCR擴增mtDNA CO I部分基因，沿用Kumar等(2007)設計的引物。引物序列為CO I-For：5′-GGATTTGGAAATTGATTAG TTCCTT-3′；CO I-Rev：5′-AAAAATTTTAATTCCAGTTGGAACAGC-3′。PCR反應體系為：1 × PCR Buffer, 1.25 mM Mg2 +, 0.4 mM dNTPs, 0.08 pM引物, 4 ng/μL總DNA 模板, 0.02 U /μL TaKaRa Taq酶。擴增條件依次為: 95℃預變性5 min；94℃變性40 s, 51℃退火1 min, 72℃延伸1 min；循環(huán)35次后，72℃延伸10 min；4℃保溫。

PCR擴增rDNA ITS序列，結合軟件Primer premier 6.0和Oligo 7.27設計引物。引物序列為：ITS-For：5′-ATTTGAATCG CTGAAGTTG-3′；ITS-Rev：5′-GTAGTCACACATTATTTGAGGC-3′，由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為：1 × PCR Buffer, 1.25 mM Mg2+, 0.4 mM dNTPs, 0.08 pM引物, 4 ng/μL總DNA 模板, 0.02 U/μL TaKaRa Taq酶。擴增條件依次為: 95℃預變性5 min；94℃變性40 s, 54℃退火1 min，(此后9個循環(huán)每個循環(huán)遞減0.5℃，至第11個循環(huán)維持48℃的退火溫度)，72℃延伸1 min；共循環(huán)35次后，72℃再延伸7 min；4℃保溫。

所有PCR產物都經1%瓊脂糖凝膠電泳、純化、回收后送至上海生物工程技術服務有限公司測序。測序結果經NCBI Blastn檢驗，確定為雜鱗庫蚊復組的基因。它們的登錄號見表1。

1.2序列信息

序列信息詳見見表1。

1.3序列處理

為確保序列的有效性，作者逐條校對、查閱了表1中所有序列的登錄信息和支撐文獻，并做BLASTn比對; 其次，在Barcode of Life Data System 網站(http://www.boldsystems.org/)進行驗證。最后選用BioEdit軟件編輯序列。

對于本次所獲得環(huán)帶庫蚊CO I部分序列，首先根據測序峰值進行人工校對，切除序列兩端不可信區(qū)域。然后使用Clustal W對所有CO I序列進多重比對，切齊序列兩端；以高保守區(qū)5′-GCAATAAATAATATAAGTTTTTGAATA-3′為起始端，切齊5′端，根據所用的最短序列切齊3′端。對于ITS序列，除去編碼rDNA 18S、5.8S和28S的序列，再拼接ITS 1和ITS 2序列，得到同一個樣本的ITS全序列。

1.4系統(tǒng)發(fā)育分析

選用MAGE 6.0分析DNA序列的組成及變異情況，并用Kimura-two-Parameter (K2P) 模型估計分化距離(K2P距離)；使用Model test 3.7估算構建ML樹的最優(yōu)模型，再以此模型建ML樹；使用Jukes-Cantor模型對平均K2P距離進行檢測，若平均距離P<1，則表示適合構建NJ建樹；使用PAUP 4.0構建ML樹。

2　結果與分析

2.1環(huán)帶庫蚊CO I部分序列 和ITS全序列

環(huán)帶庫蚊4個個體CO I部分基因，GenBank登陸號為KC876676-KC876679，長度為649-672 bp，GC含量為31.6%-32.0%，G含量為16.2%-16.3%，表現(xiàn)出很強的反G偏倚，符合昆蟲mtDNA的特點。種內4個個體僅1個個體第530位堿基較其他序列發(fā)生轉換A→G。環(huán)帶庫蚊2個個體SJ-N1和SJ-N2的“18S部分序列ITS 1-5.8S-ITS 2-28S部分序列”序列，GenBank登陸號分別為KF499144，KF4991445，長度均為903 bp，其中ITS 1為380 bp，ITS 2為253 bp，它們與早期登錄的環(huán)帶庫蚊rDNA序列AF453488所推測的ITS 1和ITS 2相比，SJ-N1樣本在ITS 2序列的第190, 191位GC堿基上發(fā)生缺失；SJ-N2樣本在ITS 1序列的250位堿基上發(fā)生轉換T→C, 在ITS 2序列的第248、249位AC堿基上發(fā)生缺失。環(huán)帶庫蚊CO I和ITS序列的堿基組成見表2。

表1　雜鱗庫蚊復組序列信息

續(xù)上表

種類Species采集地點LacalityGenBank序列號AccessionNo.文獻出處ReferenceJapan:OkinawaPrefecture,IshigakiCity,NosokoAB690857Kuwata,etal.(2007)India:PondicherryAY729975UnpublishedIndia:PondicherryAY917206UnpublishedIndia:TamilNaduDQ424952Kuwata,etal.(2007)IndiaFJ372984UnpublishedIndia:Rameswaram,TamilNaduHM638220UnpublishedIndia:DibruSaikhowa,AssamHM638221UnpublishedIndia:Dudhiya,WestBengalHM638222UnpublishedIndia:GardenReach,WestBengalHM638223UnpublishedIndia:Aimcombu,KeralaHM638224UnpublishedIndia:Tezpur,AssamHM638225UnpublishedIndia:Tezpur,AssamHM638226UnpublishedIndia:Kumarakom,KeralaHM638227UnpublishedChina:Longtang,southernYunnanProvinceJQ728031Wang,etal.(2012)China:middleHainanProvinceJQ728059Wang,etal.(2012)China:northernHainanProvinceJQ728060Wang,etal.(2012)China:middleHainanProvinceJQ728061Wang,etal.(2012)China:southernHainanProvinceJQ728062Wang,etal.(2012)China:Longtang,southernYunnanProvinceJQ728238Wang,etal.(2012)China:Gaoli,westernYunnanProvinceJQ728346Wang,etal.(2012)ITSChina:TaiwanCTU33041Miller,etal.(1996)China:TaiwanCTU33042Miller,etal.(1996)Japan:RyukyuArchipelagoAF165896Toma,etal.(2000)Japan:RyukyuArchipelagoAF165897Toma,etal.(2000)China:GuizhouEF545204UnpublishedChina:GuizhouEF545205Unpublished(outgroup)AnophelessinensisCOIChina:ShandongAY768950UnpublishedArmigeressubalbatusIndiaDQ424958UnpublishedCulexquinquefascia-tusIndiaDQ267689UnpublishedAnophelesalbimanusUnspecifiedKC354824UnpublishedAedesalbopictusITS(Stratagene,LaJolla,CA,USAoffered)L22060Kjer,etal.(1994)AnophelespseudopunctipennisMexico:NuevoLeonStateU49735Miller,etal.(1997)Culexquinquefascia-tusUSA:California,SanDiegoCoGU562872Kent,etal.(2010)AnophelesalbimanuUnspecifiedL78065Unpublished

表2　環(huán)帶庫蚊CO I和ITS序列的堿基組成

2.2分子系統(tǒng)發(fā)育樹

使用Jukes-Cantor模型分別估算CO I和ITS序列的平均K2P距離，P值結果分別為0.052和0.354，P<1，表示三組核酸序列數(shù)據均適合構建NJ樹。使用Model test 3.7估算構建ML樹的最優(yōu)模型，基于CO I和ITS序列的最優(yōu)建樹模型均為GTR+I+G，所以以此模型構建ML樹。Bootstrap=1000。結果如圖1、圖2所示。

圖1　基于CO I序列構建的雜鱗庫蚊復組系統(tǒng)發(fā)育樹，圖A最大似然法(ML)、圖B鄰接法(NJ)，置信度為50%Fig.1　Maximum-likelihood (phylogenies A) and Neighbor-Joining(phylogenies B) trees for the Culex vishnui complex are based on CO I gene, with cut-off value of 50%

圖2　基于ITS序列構建的雜鱗庫蚊復組系統(tǒng)發(fā)育樹，圖A最大似然法(ML)、圖B鄰接法(NJ)，置信度為50%Fig.2　Maximum-likelihood (phylogenies A)and Neighbor-Joining(phylogenies B) trees for the Culex vishnui complex are based on ITS sequence, with cut-off value of 50%

2.3基于CO I序列的雜鱗庫蚊復組的K2P距離

使用CO I序列計算雜鱗庫蚊復組的K2P距離并生成表格，隨后以種為單元統(tǒng)計數(shù)據，結果如表3所示。

表3　基于CO I序列的雜鱗庫蚊復組的K2P距離(%)

2.4基于CO I序列的三帶喙庫蚊的K2P距離

三帶喙庫蚊的CO I序列采集自日本、中國和印度各地區(qū)，計算它們之間的K2P距離，結果如表4。

3　結論與討論

3.1關于分子發(fā)生樹

使用CO I和ITS序列構建的ML樹和NJ樹(見圖1、圖2)，具有基本一致的拓撲結構?？偟膩砜矗s鱗庫蚊復組構成一單系群，各個種分別聚集，互為獨立的種，這與形態(tài)學分類的結果一致。其中環(huán)帶庫蚊和雜鱗庫蚊總能聚成一支，該分支與偽雜鱗庫蚊分支互為姐妹群，前三者形成的分支與三帶喙庫蚊分支互為姐妹群?？梢姯h(huán)帶庫蚊和雜鱗庫蚊享有更近的節(jié)點，這說明它們享有更近的假想祖先，擁有更近的親緣關系。同理，它們與偽雜鱗庫蚊的親緣關系較近，而與三帶喙庫蚊較遠。

其次，環(huán)帶庫蚊與雜鱗庫蚊聚類的分支更接近樹的端部，說明它們發(fā)生分化的時間較晚；三帶喙庫蚊分支最接近樹的基部，說明三帶喙庫蚊是雜鱗庫蚊復組內最早發(fā)生分化的種。

再次，CO I分子系統(tǒng)樹顯示三帶喙庫蚊分為兩個大支，一支由登錄號為AB690845-AB690855的樣本構成，采集于日本各地區(qū)，另一支采集于中國和印度。這兩大支與雜鱗庫蚊復組的其他三個種的分支互為姐妹群，提示日本的三帶喙庫蚊有種下，甚至種級分化的趨勢。

3.2關于種間K2P距離

Hebert等(2002)，通過統(tǒng)計7屬共200種鱗翅目昆蟲CO I 序列的K2P距離，提出在分子水平上界定鱗翅目的種間K2P距離是>3%。這一結果在他們的實踐中得到100%的成功，因此他們認為這種方法可以推廣用于其他物種的種的鑒定。Wang等(2012)出于同樣的思路，使用CO I序列對中國常見蚊類進行鑒定。他們統(tǒng)計了15屬122種蚊類CO I序列的K2P距離，并繪制分子發(fā)生樹(分為按蚊屬、庫蚊屬和其他蚊類三棵樹)。結果表明，超過98%的蚊類遵循種間K2P距離>2%，而種內K2P距離<2%的規(guī)律，其中包括隸屬于雜鱗庫蚊復組的三帶喙庫蚊。綜上我們推測，CO I序列的種間K2P距離2%，可以作為雜鱗庫蚊復組在分子水平上的定種閾值。

如表3所示，雜鱗庫蚊和環(huán)帶庫蚊的K2P距離是0.24%-0.72%，遠小于2%(低了一個數(shù)量級)，結果支持“環(huán)帶庫蚊是雜鱗庫蚊的同物異名”這一觀點。由于雜鱗庫蚊與環(huán)帶庫蚊報告于同一期期刊，但因為報告雜鱗庫蚊的篇幅(355頁)略前于環(huán)帶庫蚊的(358頁)(Reuben, 1969)，所以依照國際命名法規(guī)，將環(huán)帶庫蚊改稱為雜鱗庫蚊是可取的。

此外，就種間K2P距離來說，雜鱗庫蚊(含環(huán)帶庫蚊)與偽雜鱗庫蚊、三帶喙庫蚊的K2P距離分別為4.41%-6.74%、4.92%-7.26%；偽雜鱗庫蚊和三帶喙庫蚊的K2P距離為6.98%-9.68%，結果均大于2%兩倍以上，再次證明雜鱗庫蚊復組3個親緣種互為獨立的種。

就種內K2P距離而言，雜鱗庫蚊樣本采集于印度大陸多處，環(huán)帶庫蚊樣本采自于中國貴陽，它們的種內K2P距離分別為0.53%和0；偽雜鱗庫蚊采自于印度大陸和日本各島，它的種內K2P距離為1.36%。上述兩個種的種內K2P距離都未超過2%。

例外的是三帶喙庫蚊(如表4所示)，它們采集于中國、印度和日本，種內K2P距離在0-6.76%，整體來看并不遵守“2%規(guī)律”，但實際上主要是來自于日本的三帶喙庫蚊打破了這一規(guī)律。按照CO I分子樹的結構，將三帶喙庫蚊劃分為日本產地和中、印產地兩個類群，兩個類群內部的K2P距離分別為0.48%-2.68%，和 0-2.68%，基本遵循“2%規(guī)律”，屬于種內的變化范圍。但是日本產地的類群，與中、印產地的K2P距離，即兩個類群之間的K2P距離為4.17%-6.76%。這一數(shù)值近似于雜鱗庫蚊(含環(huán)帶庫蚊)與偽雜鱗庫蚊之間的K2P距離(4.41%-6.74%)，即種間的分化距離。綜上，我們推測日本的三帶喙庫蚊有種下，甚至種級分化的趨勢。形成這一結果的可能原因是，日本列島地處歐亞大陸板塊、北美洲板塊、太平洋板塊及菲律賓板塊4個板塊的交界處，地形地貌比較復雜，此外它與中國、印度所處的歐亞大陸有海洋間隔，為適應環(huán)境，三帶喙庫蚊在擴散的途中產生較大的變異，甚至發(fā)生種下或種級的分化。不過更確鑿的結論還需要進一步調查和實驗研究才能獲得。

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Molecular phylogeny ofCulexvishnuicomplex (Diptera: Culicidae) based on CO I and ITS sequences

ZHAO Wen-Jing, ZHANG Chun-Lin*, CHEN Han-Bin, ZHANG Jing, LIU Bin

(Department of Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Discussions about the classification status ofCulexannulusand the relationship ofC.vishnuicomplex were held with the Kimura-two-Parameter (K2P) distances based on CO I and phylogenetic trees based on CO I and ITS. The K2P distance betweenC.annulusandC.vishnuiwas 0.24%-0.72%, which supported “C.annulusis a synonym ofC.vishnui”.The interspecific K2P distance amongC.vishnui(containingC.annulus),C.pseudovishnuiandC.tritaeniorhynchuswere 4.41%-9.68%. From the view of the phylogenetic trees, each species respectively gathered and became sister group each other, which demonstrated again their being independent species of one another.C.annulusandC.vishnuibeing at the top of the phylogenetic trees indicated that they differentiated later, whileC.tritaeniorhynchusbeing at the root indicated that differentiated earlier.The intraspecific K2P distance ofC.tritaeniorhynchusmined in Japan was 0.48%-2.68%, and the interspecific K2P distances among those mined in Japan, China and India was 4.17%-6.76%.Furthermore, according to the phylogenetic trees,C.tritaeniorhynchusfrom Japan formed a branch themselves, then became the sister group with the branch formed by those from China and India. These results implied that JapaneseC.tritaeniorhynchushad the trend to differentiate at subspecies or even species level.

Culexvishnuicomplex; nucleotide sequences; K2P distance; phylogeny

貴州省科學技術基金項目(黔科合J字(2006)2077)；貴州醫(yī)科大學青年基金項目 (K2010-30)。

趙文靜，女，碩士，主要從事昆蟲分子學研究，E-mail: ellenzhwj@foxmail.com

Author for correspondence, E-mail: zcl@gmc.edu.cn

2015-10-18；接受日期Accepted:2015-12-16

Q963

A

1674-0858(2016)04-0821-10