王娟，元正菊，何于雯，李楠，孟錦昕，王靜林

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲是危害人畜的重要昆蟲媒介，通過叮咬傳播西尼羅病毒性腦炎、乙型腦炎、圣路易斯腦炎、禽瘧疾、班氏絲蟲等多種疾病[1-4]。尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲包括尖音庫蚊指名亞種(CulexpipienspipiensLinnaeus,1758)、致倦庫蚊(Cx.pipiensquinquefasciatusSay,1823)、淡色庫蚊(Cx.pipienspallensCoquillett, 1898)和騷擾庫蚊(Cx.pipipensmolestusForskal, 1775)等4種蚊蟲[5]。4種蚊蟲在全世界廣泛分布，在我國也有分布，典型的尖音庫蚊分布在新疆，淡色庫蚊分布于北方地區(qū)(北緯 32°～34°以北)，致倦庫蚊分布于我國的南方地區(qū)(北緯32°～34°以南)以及南方島嶼如臺灣島和海南島，淡色庫蚊和致倦庫蚊地區(qū)分布存在一定的交差重疊[5-8]。由于這4種蚊蟲的形態(tài)學(xué)比較相近，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法難以準(zhǔn)確地對它們進行分類，有關(guān)致倦庫蚊、淡色庫蚊的分類地位等問題一直存在爭議[9]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國外不少學(xué)者應(yīng)用線粒體I(COI)DNA序列分析作為一種研究昆蟲系統(tǒng)進化關(guān)系的手段，并有一些蚊蟲系統(tǒng)進化關(guān)系研究的報道[10,11]。為此，將采用分子生物學(xué)方法對采集自昆明地區(qū)的蚊蟲進行分子鑒定，從分子水平明確昆明地區(qū)尖音庫蚊的分類地位。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲采集

于2017年5月17日—21日在云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院家屬區(qū)室內(nèi)采集蚊蟲標(biāo)本。在19：30—22：30，采用人誘法用電動吸蚊器捕捉蚊蟲，把采集的蚊蟲放入-20℃冰箱中冰凍30 min，在體視顯微鏡下觀察蚊蟲的形態(tài)特征，并參照《中國重要醫(yī)學(xué)昆蟲分類與鑒別》[12]進行分類鑒定，然后把蚊蟲浸泡在70%乙醇中，-20℃冰箱保存。

1.2 蚊蟲基因核酸提取和基因擴增

在采集到的淡色蚊蟲標(biāo)本中隨機抽取10只蚊蟲標(biāo)本進行基因組DNA提取。具體提取方法如下：從乙醇中取出蚊蟲標(biāo)本放入無菌玻璃研磨器中，讓蚊蟲表面乙醇稍稍揮發(fā)，除去蚊蟲翅膀和足，用基因組DNA 提取試劑盒(天根公司) 按照說明書提取蚊蟲基因組DNA。參照文獻引物分別對昆明淡色庫蚊COI[11]、COII[11]和ITS[3]基因進行PCR擴增。50 μL 反應(yīng)體系: DEPC處理水32 μL , 10×rTaq 緩沖液 5 μL，上下游引物各(20μmol/L) 1.25μL，2.5mmol/L dNTP 5μL，rTaq 酶0.5μL (2.5U)，模板5μL。COI和COII基因PCR擴增程序為94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 60s，35個循環(huán)，72℃延伸10min。ITS基因PCR擴增程序退火溫度為55℃，其余程序與COI和COII基因擴增程序相同。取5μL PCR 擴增產(chǎn)物點樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物送測序公司(擎科生物)進行測序。

1.3 序列分析

采用 DNA Star 軟件中SeqMan拼接序列，使用MEGA X 軟件中Aling 進行序列比對和DNA Star軟件中MegAlign進行核苷酸同源性分析。使用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，構(gòu)建方法采用Neighbour-joining (NJ) 法，bootstrap值為1000。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本采集

2017年5月17日—22日在昆明市青龍山云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院家屬區(qū)室內(nèi)共采集到蚊蟲標(biāo)本50只，均為雌蟲。

2.2 淡色庫蚊形態(tài)學(xué)鑒定

50只蚊蟲均具有相同的形態(tài)特征：中等大小，淡棕色；喙色暗，中段色淡，但喙無清楚界限的白環(huán)，腹節(jié)背板有淡色基帶，淡色基帶平齊并與腹側(cè)板相連，前中后各跗節(jié)均為暗褐色，無淡色環(huán)。

圖1 昆明尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲形態(tài)特征

2.3 分子鑒定

2.3.1核苷酸同源性分析

分別采用蚊蟲COI、COII和ITS 3個基因特異引物對1只在昆明地區(qū)采集的尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲標(biāo)本進行PCR擴增，3對引物擴增均為陽性，測序后分別獲得COI、COII和ITS基因序列650個核苷酸(nt)、490nt和619nt。對昆明采集的尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲進行的核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，該只蚊蟲COI基因、COII基因和ITS基因與尖音庫蚊復(fù)合組的尖音庫蚊、淡色庫蚊、致倦庫蚊和騷擾庫蚊核苷酸序列同源性最高，分別在99.8%～100%、99.8%～100%、96.4%～99.9%，而與其他庫蚊核苷酸同源性分別低于97.2%、96.5%和90%；進一步分析發(fā)現(xiàn)，昆明采集的蚊蟲COI基因和COII基因與尖音庫蚊、淡色庫蚊、致倦庫蚊和騷擾庫蚊核苷酸同源性均在99.8%以上，ITS基因與尖音庫蚊和騷擾庫蚊核苷酸同源性較高在99.1%～99.9%，而與淡色庫蚊和致倦庫蚊核苷酸同源性在96.4%～96.6%，見表1。

表1 昆明地區(qū)采集蚊蟲與尖音庫蚊和其他庫蚊核苷酸同源性分析

2.3.2遺傳進化分析

云南省昆明市盤龍區(qū)采集1只蚊蟲COI、COII和ITS基因分別與GenBank 中45條相應(yīng)基因序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖2)。結(jié)果顯示在COI、COII和ITS 3個基因進化樹上，昆明采集蚊蟲M1與尖音庫蚊復(fù)合組的尖音庫蚊、騷擾庫蚊、淡色庫蚊和致倦庫蚊一起位于同一進化分支內(nèi)；在COI和COII基因構(gòu)建的進化樹上，尖音庫蚊復(fù)合組的蚊蟲形成4個進化分支，但該復(fù)合組的4種蚊蟲難于從COI和COII系統(tǒng)進化樹上區(qū)分開來，本研究采集蚊蟲M1與尖音庫蚊、騷擾庫蚊、淡色庫蚊和致倦庫蚊部分蚊蟲株位于一個較小進化分支之內(nèi)；而在ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹上，尖音庫蚊復(fù)合組的4種蚊蟲形成三個較小的進化分支，昆明采集蚊蟲M1與尖音庫蚊和騷擾庫蚊位于同一較小進化分支內(nèi)。

3 討論

蚊蟲是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上重要的媒介昆蟲，種類非常多，分布范圍廣泛，以熱帶、亞熱帶地區(qū)蚊蟲種類最為豐富，蚊蟲密度也較高。不同蚊蟲種類或亞種傳播人或動物疾病的效能存在明顯差異，所以蚊蟲種類、地理分布直接關(guān)系到人或動物疾病的傳播、流行及分布[13]，因此，有必要對蚊蟲進行準(zhǔn)確的分類鑒定，對了解蚊蟲傳播疾病的流行和防控具有重要意義。本次研究在昆明地區(qū)采集到50只蚊蟲，在形態(tài)上具有喙無清楚界限的白環(huán)、腹節(jié)背板有淡色基帶且平齊或微凸或微凹與腹側(cè)板相連、各足跗節(jié)全部色暗、無淡色環(huán)等特征，這與尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲形態(tài)特征相似，形態(tài)學(xué)鑒定這些蚊蟲為尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲。

A.COI基因進化樹；B.COII基因進化樹；C.ITS基因進化樹；NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值為1000。

由于尖音庫蚊復(fù)合組的4種蚊蟲形態(tài)學(xué)上非常相似，從形態(tài)學(xué)上難以很好鑒別，容易導(dǎo)致相近蚊蟲種類的錯誤分類[9]，因此，需要一種新的方法來準(zhǔn)確鑒定蚊蟲種類，而分子鑒定方法是一個不錯的選擇。目前，蚊蟲分子鑒定常選用線粒體基因COI、COII、COIII以及ITS基因作為分子靶標(biāo)進行分類鑒定[11]。鑒于此，本次研究選用線粒體基因COI和COII、ITS 3個基因作為分子靶標(biāo)進行分子鑒定，遺傳進化分析結(jié)果表明昆明采集的蚊蟲M1與尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲遺傳進化密切，從分子水平提示M1為尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲，但是采用COI和COII基因進行的遺傳進化分析難以明確昆明采集的M1具體分類。而通過ITS基因遺傳進化分析可以把尖音庫蚊/騷擾庫蚊、淡色庫蚊、致倦庫蚊鑒別開來，但不能很好鑒別尖音庫蚊和騷擾庫蚊。本次昆明采集蚊蟲M1在ITS基因遺傳進化關(guān)系中與尖音庫蚊和騷擾庫蚊較密切，同源性也非常高，提示昆明采集的M1蚊蟲可能為與尖音庫蚊或騷擾庫蚊關(guān)系密切的蚊蟲，其分類地位的確定還有待于進一步研究。

尖音庫蚊復(fù)合組各亞種的形態(tài)特征很相似，鑒別的重要形態(tài)特征是雄性蚊蟲生殖器陽莖側(cè)板中葉的形態(tài)差異[14]。遺憾的是本次在昆明地區(qū)沒有采集到雄性庫蚊，因此，難以有效地對這批雌蚊進行亞種的鑒定。 為了填補這個遺憾，本研究同時擴增了蚊蟲的COI、COII和ITS 3個基因，并進行系統(tǒng)的遺傳進化分析，以期能夠明確昆明地區(qū)尖音庫蚊復(fù)合組的亞種，但是對這3個基因的分析還難以區(qū)別開尖音庫蚊或騷擾庫蚊。因此，為了更清楚地明確昆明地區(qū)尖音庫蚊復(fù)合組蚊蟲的亞種，還有待于在該地區(qū)采集雄蚊以及尋找更多的分子靶標(biāo)開展進一步分類研究。