呂 冰 邱德來 初春平 金 日 金文哲

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，吉林 延吉 133000)

丙泊酚對在體小鼠小腦皮層浦肯野細(xì)胞自發(fā)性活動(dòng)的影響

呂 冰 邱德來1初春平1金 日2金文哲

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，吉林 延吉 133000)

目的 探討丙泊酚對在體小鼠小腦皮層浦肯野細(xì)胞自發(fā)性單純性放電活動(dòng)、自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電特性的影響。方法 選用6～8周齡ICR小鼠6只，腹腔注射烏拉坦麻醉，在小腦CrusⅡ小葉行開顱手術(shù)，開孔直徑為1.0～1.5 mm，去除硬腦膜后，用蠕動(dòng)泵在腦表面持續(xù)灌流含氧的人工腦脊液，浦肯野細(xì)胞貼附式記錄使用Multi clamp700B膜片鉗放大器，通過D/A轉(zhuǎn)換器1440和Clampfit 10.3軟件獲取浦肯野細(xì)胞自發(fā)性活動(dòng)數(shù)據(jù)。待自發(fā)性活動(dòng)記錄穩(wěn)定后，給予丙泊酚，觀察其對浦肯野細(xì)胞自發(fā)性單純峰電位(SS)和復(fù)雜峰電位(CS)活動(dòng)的影響。結(jié)果 腦表面給予丙泊酚劑量依存地抑制小鼠小腦浦肯野細(xì)胞自發(fā)性SS放電活動(dòng)，其半數(shù)抑制濃度為143 μmol/L，當(dāng)濃度為500 μmol/L時(shí)自發(fā)性SS放電完全抑制，然而，丙泊酚對自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電頻率和波形特征無顯著影響。結(jié)論 在體條件下，腦表面灌流丙泊酚顯著抑制浦肯野細(xì)胞自發(fā)性SS放電活動(dòng)。

丙泊酚；浦肯野細(xì)胞；小腦皮層；細(xì)胞貼附式記錄

丙泊酚由于起效快、清除迅速和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于全麻誘導(dǎo)與維持、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)患者鎮(zhèn)靜、無痛胃腸鏡及無痛人流手術(shù)中。離體和在體實(shí)驗(yàn)均表明丙泊酚可通過活化γ-氨基丁酸(GABA)A型受體(GABAA)和甘氨酸受體對脊髓、海馬和下丘腦神經(jīng)元的活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用；然而，丙泊酚對在體動(dòng)物小腦皮層神經(jīng)元活動(dòng)的影響報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用細(xì)胞吸附式技術(shù)手段，在活體動(dòng)物上觀察丙泊酚的攝入對小鼠小腦皮層浦肯野細(xì)胞(PC)自發(fā)性活動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇和主要試劑 選用6～8周齡健康雄性ICR小鼠6只，體重28～32 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。丙泊酚(批號(hào)：16IF1533)。人工腦脊液(ACSF)由以下成分組成(mmol/L):125 NaCl，3 KCl，1 MgSO4,2 CaCl2，1 NaH2PO4，25 NaHCO3，10 D-glucose。ACSF的滲透壓為290～300 MOSM，pH 7.2～7.4。

1.2 主要儀器 美國產(chǎn)Multi clamp700B膜片鉗放大器、1440AD/DA轉(zhuǎn)換器、日本Nikon公司產(chǎn)膜片鉗專用顯微鏡、美國Sutter公司生產(chǎn)的電動(dòng)微操縱器(MP 385和MP 285)、微量噴射器(Picospritzer Ⅲ，美國)、德國萊卡公司生產(chǎn)的DM5500B顯微鏡、法國產(chǎn)Minipuls3蠕動(dòng)泵、日本精密牙科鉆及電極拉制儀等。

1.3 動(dòng)物模型的制備 小鼠腹腔注射烏拉坦麻醉后固定在自制的腦定位儀上，通過加熱墊使麻醉小鼠的體溫穩(wěn)定在(37.0±0.2)℃。在小腦手術(shù)部位周圍制作一個(gè)防漏水記錄槽后實(shí)施開顱手術(shù)〔直徑(1.0±1.5)mm〕，除去硬腦膜后暴露出小腦皮層CrusⅡ部位進(jìn)行電生理記錄。手術(shù)暴露腦表面部位用蠕動(dòng)泵持續(xù)灌流給予人工腦脊液(ACSF)，待自發(fā)性活動(dòng)記錄穩(wěn)定后，給予丙泊酚。

1.4 PC放電記錄 使用自動(dòng)拉制儀將細(xì)玻璃管拉制成記錄電極，填充20～30 μl ACSF，將記錄電極安裝于電動(dòng)微操作器上，通過顯微鏡觀測電極移動(dòng)，在顯微鏡下確定記錄部位后，將記錄電極準(zhǔn)確置于記錄區(qū)域。PC貼附式記錄使用Multi clamp700B放大器，通過D/A轉(zhuǎn)換器1440和Clampfit10.3軟件獲取PC自發(fā)性活動(dòng)數(shù)據(jù)。記錄電極內(nèi)填充ACSF，填充后阻抗為3～5 MΩ。在細(xì)胞貼附式記錄條件下，PC是通過其獨(dú)特的單純和復(fù)雜放電模式認(rèn)定的。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 高濃度丙泊酚對小腦PCs自發(fā)性簡單峰電位和復(fù)雜峰電位放電率的影響 在細(xì)胞貼附式記錄模式下，通過自發(fā)性規(guī)律簡單峰電位(SS)和不規(guī)律復(fù)雜峰電位(CS)的放電特征，共有22個(gè)神經(jīng)元被認(rèn)定為PC。小腦表面給予丙泊酚(500 μmol/L)完全抑制自發(fā)性單純性放電，PC自發(fā)性SS放電頻率較給藥前相比降低了99.5%，但對自發(fā)性復(fù)雜峰電位放電頻率無顯著影響。見圖1。

A，給予ACSF(上面)和500 μmol/L丙泊酚(下面)記錄的PCs的SS；1)表示復(fù)雜峰電位；B，500 μmol/L丙泊酚誘導(dǎo)的PCs單純性放電頻率變化的時(shí)間過程；C，500 μmol/L丙泊酚誘發(fā)PCs單純性放電頻率變化的時(shí)間過程統(tǒng)計(jì)圖圖1 高濃度丙泊酚對小腦PCs自發(fā)性簡單峰電位和復(fù)雜峰電位放電率的影響

2.2 丙泊酚對PCs自發(fā)性SS抑制作用的劑量依存關(guān)系丙泊酚對小鼠小腦PCs自發(fā)性SS活動(dòng)的抑制具有劑量依存性，可引起PCs自發(fā)性SS放電顯著抑制的最小濃度為10 μmol/L，其抑制程度可達(dá)3%左右；半數(shù)有效抑制濃度為143 μmol/L，500 μmol/L的丙泊酚已經(jīng)達(dá)到最大抑制濃度。見圖2。

2.3 丙泊酚對PCs自發(fā)性復(fù)雜峰電位特征的影響 雖然丙泊酚對PC自發(fā)性SS放電明顯抑制，但不影響CS自發(fā)性活動(dòng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在丙泊酚存在條件下CS自發(fā)性活動(dòng)頻率為0.53 Hz，與給藥前(0.46 Hz)相比無顯著差異(P>0.05)。而CS放電小穗平均數(shù)量為3.3 個(gè)，與給藥前(3.3 個(gè))比較也無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖2 丙泊酚對PCs自發(fā)性SS抑制作用的劑量依存關(guān)系

圖3 丙泊酚對PCs自發(fā)性復(fù)雜峰電位特征的影響

3 討 論

小腦皮層主要通過苔狀纖維(MF)和爬行纖維(CF)傳入外部信息，參與精細(xì)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)。一般認(rèn)為，經(jīng)MF傳入的感覺信息通過顆粒細(xì)胞的軸突-平行纖維途徑間接地興奮PC，表現(xiàn)為簡單峰電位(simple spike)，而經(jīng)CF傳入的感覺信息可興奮PC，表現(xiàn)為復(fù)雜峰電位(complex spikes)〔1〕。MLI是PC的抑制性中間神經(jīng)元，分為籃狀細(xì)胞(BC)和星狀細(xì)胞(SC)。BC的軸突末梢包裹在PC的胞體和軸突起始段，其興奮可使PC產(chǎn)生迅速而強(qiáng)烈的環(huán)胞體抑制，直接影響PC峰電位的輸出；而SC的軸突選擇性地與PC樹突形成抑制性突觸聯(lián)系，SC興奮可對PC樹突產(chǎn)生抑制，分流平行纖維的興奮性傳入，平衡PC樹突的興奮性〔2〕。Chu等〔3～5〕發(fā)現(xiàn)感覺刺激不能興奮PC，反而興奮MLIs，導(dǎo)致 PC產(chǎn)生抑制、單純性放電暫停。

靜脈麻醉藥對神經(jīng)系統(tǒng)功能影響機(jī)制的研究方法分為離體腦片記錄和在體記錄兩大類。腦片標(biāo)本保持了部分在體情況下的神經(jīng)通路，并且易于施加藥物和觀察藥物的直接作用，但是腦片的制備過程比較復(fù)雜，且不可避免地?fù)p傷復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，因此腦片僅是對生理?xiàng)l件的近似模擬。在體電生理記錄的優(yōu)勢在于能真實(shí)地反映生理狀態(tài)下神經(jīng)突觸傳遞的情況，能夠在整體條件下觀察神經(jīng)突觸活動(dòng)的變化，利于從宏觀角度研究和探討靜脈麻醉藥物的作用機(jī)理。

Jin等〔6〕在體研究小鼠小腦表面給予丙泊酚 (10～1 000 μmol/L)劑量-依存性地抑制PCs SS頻率，半數(shù)有效濃度為144.5 μmol/L。大劑量完全抑制PCs自發(fā)性SS，但對CS放電頻率和波形特征無顯著影響。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在體小腦表面灌流丙泊酚(10～1 000 μmol/L)顯著降低感覺刺激誘發(fā)抑制GABA能突觸傳遞反應(yīng)的振幅和波形下面積，但明顯增加該反應(yīng)波形的上升時(shí)間與延遲時(shí)間。

腦表面灌流丙泊酚可顯著增加感覺刺激誘發(fā)興奮性反應(yīng)的振幅和波形下面積，同時(shí)也增加該反應(yīng)的上升時(shí)間和延遲時(shí)間。丙泊酚對小腦皮層感覺信息傳遞的影響可以被GABAA受體阻斷劑阻斷。上述結(jié)果表明丙泊酚通過調(diào)控成年小鼠GABAA受體活化影響感覺信息在小腦皮層分子層神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中傳遞的動(dòng)力學(xué)特征〔7〕。另有研究表明，丙泊酚通過活化N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)受體顯著增強(qiáng)小鼠面部感覺刺激誘發(fā)的顆粒細(xì)胞層場電位反應(yīng)，但丙泊酚對顆粒細(xì)胞層感覺刺激誘發(fā)場電位的增強(qiáng)作用與GABAA受體活化無關(guān)，進(jìn)一步揭示了丙泊酚導(dǎo)致面部感覺刺激誘發(fā)小腦分子層和PC平行纖維興奮性傳入的增強(qiáng)機(jī)制〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體條件下，腦表面灌流丙泊酚顯著抑制浦肯野細(xì)胞自發(fā)性SS放電活動(dòng)。在以后的研究中，有必要進(jìn)一步深入研究丙泊酚對小腦神經(jīng)元環(huán)路、感覺信息傳遞及突觸可塑性的影響機(jī)制。

1 韓濟(jì)生.神經(jīng)科學(xué)〔M〕.第3版.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2008:796-818.

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〔2015-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金(81560194)；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2016第267號(hào))；延邊大學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(延大科合字2014第38號(hào))

金 日(1975-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事運(yùn)動(dòng)損傷和關(guān)節(jié)外科的診療。 金文哲(1971-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事靜脈麻醉藥影響小腦皮層功能方面的研究。

呂 冰(1991-)，男，碩士，主要從事神經(jīng)病理性疼痛電生理機(jī)制的研究。

R74

A

1005-9202(2017)01-0017-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.007

1 吉林省細(xì)胞功能與藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室 2 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院骨科