劉曉剛 程大銘 王利兵

(唐山市工人醫(yī)院肝膽外科，河北 唐山 063000)

·消化、呼吸系統(tǒng)疾病·

老年晚期惡性梗阻性黃疸患者小腸黏膜中黏蛋白-2表達(dá)變化及不同療法的效果

劉曉剛 程大銘 王利兵

(唐山市工人醫(yī)院肝膽外科，河北 唐山 063000)

目的 探討老年晚期惡性梗阻性黃疸患者小腸黏膜中黏蛋白-2表達(dá)變化及3種姑息療法的效果分析。方法 惡性膽管梗阻患者88例，分為惡性膽管梗阻伴黃疸組56例，惡性膽管梗阻無黃疸組32例；另收集同期行胃鏡檢查的健康老年人30例為正常對照組。每位受試者在逆行胰膽管造影或胃鏡檢查時(shí)鉗取8塊腸黏膜組織，分別行HE染色，在透射電鏡下觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變，AB-PAS染色，免疫組化染色檢測黏蛋白-2表達(dá)情況。根據(jù)治療方法不同將惡性膽管梗阻伴黃疸患者分為采取Roux-en-Y吻合術(shù)(膽腸吻合組)、ERCP并膽管支架置入術(shù)(ERCP組)、PTCD組，觀察治療前后患者肝功能、體能、并發(fā)癥情況。結(jié)果 HE染色顯示，惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸黏膜絨毛完整性部分破損。電鏡下觀察惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸黏膜微絨毛變短、稀釋、排列不齊，杯狀細(xì)胞經(jīng)復(fù)合胞吐釋放出大量黏蛋白。AB-PAS染色顯示，惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸杯狀細(xì)胞數(shù)明顯少于惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組(P<0.05)；惡性膽管梗阻無黃疸組與健康對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。免疫組化染色顯示，惡性膽管梗阻伴黃疸組患者黏膜-蛋白2陽性細(xì)胞表達(dá)水平明顯低于惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組(P<0.05)；惡性膽管梗阻無黃疸組與健康對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后7 d 3組患者總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GT)均明顯低于術(shù)前(P<0.05)；3組間TBIL、ALT、γ-GT水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。膽腸吻合組住院時(shí)間明顯長于ERCP組和PTCD組(P<0.05)。ERCP組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于PTCD組和膽腸吻合組，PTCD組明顯低于膽腸吻合組(P<0.05)。結(jié)論 梗阻性黃疸患者小腸黏膜黏蛋白-2數(shù)量明顯減少，是導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷的主要機(jī)制之一；杯狀細(xì)胞可通過復(fù)合胞吐釋放大量黏蛋白-2修復(fù)受損的黏液層，維持屏障功能。老年晚期惡性梗阻性黃疸患者行ERCP 膽道支架治療在保證療效基礎(chǔ)上可有效降低并發(fā)癥發(fā)生率，縮短住院時(shí)間。

惡性梗阻性黃疸；小腸黏膜；黏蛋白-2

梗阻性黃疸是臨床常見的膽系疾病，其主要病理機(jī)制為腸黏膜屏障功能受損，引發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥。黏蛋白-2是一種糖基化分泌型黏蛋白，主要由杯狀細(xì)胞經(jīng)胞吐作用分泌，是防御腸道致病菌及內(nèi)源性有害物質(zhì)侵入的天然屏障〔1〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，黏蛋白-2參與維持腸黏膜屏障〔2〕；但關(guān)于梗阻性黃疸患者腸黏膜黏蛋白-2表達(dá)變化的研究十分少見。惡性梗阻性黃疸多因轉(zhuǎn)移性癌侵犯膽總管引發(fā)膽管狹窄〔3〕，老年晚期惡性梗阻性黃疸患者由于機(jī)體器官功能衰退，免疫系統(tǒng)反應(yīng)性差，死亡率很高；且多數(shù)患者確診時(shí)已失去根治術(shù)機(jī)會(huì)，需行姑息性治療減輕黃疸癥狀，改善肝功能〔3〕。本次研究通過檢測老年晚期惡性梗阻性黃疸患者小腸黏膜形態(tài)學(xué)和黏蛋白-2表達(dá)的變化情況，進(jìn)一步分析其在腸黏膜屏障損失中的作用；同時(shí)比較三種姑息治療方法的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2016年4月本院收治的惡性膽管梗阻患者88例，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲，術(shù)前經(jīng)影像學(xué)檢查或穿刺病理活檢診斷為惡性膽管梗阻；②術(shù)前評估無行根治手術(shù)機(jī)會(huì)；③患者自愿參與本次研究，簽署知情同意書。根據(jù)是否伴有黃疸分為惡性膽管梗阻伴黃疸組56例，男36例，女20例；年齡60～89〔平均(72.69±10.34)〕歲，血清總膽紅素(TBIL)49.10～455 μmol/L；惡性膽管梗阻無黃疸組32例，男20例，女12例；年齡60～87〔平均(72.38±9.55)〕歲，血清TBIL 7.9～18.40 μmol/L。另收集同期行胃鏡檢查的健康老年人30例為正常對照組，男18例，女12例，年齡60～83〔平均(70.42±5.13)〕歲，血清TBIL 5.9～18.0 μmol/L。三組性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人黏蛋白-2抗體(美國hyclone-pierce公司)；SP9001試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(北京欣興唐生物科技有限公司)；AB-PAS染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；石蠟切片機(jī)(德國SLEE)；H-9500透射電子顯微鏡(天美科學(xué)儀器有限公司)；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 取材及檢測 每位受試者在逆行胰膽管造影或胃鏡檢查時(shí)，在十二指腸乳頭瘤體病變下方2～5 cm范圍(健康者在十二指腸乳頭下方2～5 cm)內(nèi)鉗取8塊腸黏膜組織。10%甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。①取其中2塊組織行HE染色，觀察腸黏膜的形態(tài)學(xué)改變和病理學(xué)評分。②2塊在電子顯微鏡下觀察腸黏膜超微形態(tài)改變和腸內(nèi)杯狀細(xì)胞變化。③2塊行AB-PAS染色觀察：將切片常規(guī)脫蠟至水，阿爾辛藍(lán)染色30 min，蒸餾水沖洗3 min，1%高碘酸染色20 min，蒸餾水沖洗3次，AB-PAS染色20 min，蒸餾水沖洗3 min，脫水、透明；中性樹膠封片。④2塊行免疫組化檢測黏蛋白-2分布和表達(dá)情況：石蠟切片脫蠟至水，水浴抗原修復(fù)后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加3%過氧化氫，孵育15 min，加山羊血清封閉特異性抗體，孵育30 min，濾紙吸干多余血清，加一抗(1∶1 000稀釋)，PBS代替一抗作陰性對照，4℃冷藏過夜；加生物素標(biāo)記的二抗，濕盒內(nèi)孵育30 min，加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉卵白素，二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后顯微鏡下觀察終止反應(yīng)，脫水、透明，中性樹脂封片。

1.4 結(jié)果判斷 光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色形態(tài)學(xué)改變，采用Chiu氏評分評定小腸黏膜損傷程度。采用Image-Pro Plus 分析軟件，相同放大倍數(shù)下對圖像進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)5個(gè)視野，進(jìn)行AB-PAS染色陽性細(xì)胞的平均光密度值分析。免疫組化染色呈棕黃色為陽性，每個(gè)患者取3張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，以陽性細(xì)胞染色OD值表示抗原表達(dá)。

1.5 治療方法 惡性膽管梗阻伴黃疸患者行膽管空腸Roux-en-Y吻合術(shù)(膽腸吻合組)16例，離斷遠(yuǎn)端空腸，梗阻近端行膽管空腸端吻合，近、遠(yuǎn)端空腸行端側(cè)吻合。經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)并膽管支架置入術(shù)(ERCP組)29例，先行ERCP，明確梗阻病灶情況后插入導(dǎo)絲，選擇合適尺寸的膽道支架，循導(dǎo)絲置入后釋放，X線透視下確定放入位置和釋放情況，內(nèi)鏡下觀察引流情況。經(jīng)皮肝穿刺膽道引流(PTCD)組11例，以超聲探查結(jié)果和肝內(nèi)膽管擴(kuò)展情況選取穿刺點(diǎn)，患者取側(cè)臥位，常規(guī)消毒、局麻后，18 G針穿刺，到靶點(diǎn)后取出針芯，放入引導(dǎo)絲到肝內(nèi)擴(kuò)張膽管。將PTCD引流管置入后拔出引導(dǎo)絲，連接引流袋。術(shù)后均給予抗炎、保肝、止血治療，內(nèi)引流者給予抗胰腺炎治療；觀察治療前后肝功能、體能、并發(fā)癥情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察和腸黏膜損傷評估 惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸黏膜絨毛完整性部分破損，表現(xiàn)為絨毛頂端間隙變大，兩側(cè)存在分離且部分絨毛頂端上皮破壞；惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組患者腸黏膜絨毛完整性較好，呈指狀突起，上皮細(xì)胞排列緊密。Chiu氏評分：惡性膽管梗阻伴黃疸組為3.65±1.16，明顯高于惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組的1.24±0.46、1.20±0.69(P<0.05)，無黃疸組與健康對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖1。

A 惡性膽管梗阻伴黃疸組；B惡性膽管梗阻無黃疸組；C 健康對照組；下圖同圖1 各組腸道黏膜的組織學(xué)形態(tài)(HE染色，×100)

2.2 腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變 電鏡下觀察惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸黏膜微絨毛變短、稀釋、排列不齊，杯狀細(xì)胞經(jīng)復(fù)合胞吐釋放出大量黏蛋白；惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組患者腸黏膜杯狀細(xì)胞飽滿，微絨毛排列整齊，排秘活動(dòng)不明顯。見圖2。

圖2 各組腸黏膜超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

2.3 AB-PAS染色情況 惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸杯狀細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分向腸腔內(nèi)部分泌大量黏蛋白；惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組患者腸杯狀細(xì)胞飽滿且均勻分布于腸黏膜上皮，呈紫紅色。惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸杯狀細(xì)胞數(shù)OD值為0.16±0.04，明顯少于惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組的0.33±0.05、0.36±0.04(P<0.05)；惡性膽管梗阻無黃疸組與健康對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組腸黏膜AB-PAS染色(×400)

2.4 黏蛋白-2免疫組化染色情況 惡性膽管梗阻伴黃疸組患者腸黏膜-2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)OD值為0.19±0.04，明顯低于惡性膽管梗阻無黃疸組和健康對照組的0.37±0.09、0.35±0.06(P<0.05)；惡性膽管梗阻無黃疸組與健康對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖4。

2.5 惡性膽管梗阻伴黃疸患者術(shù)后恢復(fù)情況 三組患者術(shù)后黃疸、皮膚瘙癢等癥狀逐漸消失或減輕，體能得到改善。術(shù)后7 d后3組患者TBIL、ALT、γ-GT均明顯低于術(shù)前(P<0.05)；3組間TBIL、ALT、γ-GT水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

圖4 各組黏蛋白-2免疫組化染色(×400)

組別nTBIL(μmol/L)術(shù)前術(shù)后7dALT(U/L)術(shù)前術(shù)后7dγ-GT(U/L)術(shù)前術(shù)后7d膽腸吻合組16349.51±65.37210.51±60.301)238.71±38.06126.25±19.631)446.31±115.64220.91±70.641)ERCP組29390.26±69.50218.46±51.491)253.16±58.33135.68±45.811)523.18±102.58261.48±62.131)PTCD組11416.13±64.19226.69±39.581)188.20±42.1699.31±24.731)460.73±96.34211.29±65.391)

與術(shù)前相比：1)P<0.05

2.6 惡性膽管梗阻伴黃疸患者住院時(shí)間 膽腸吻合組住院時(shí)間(14.31±6.48)d，明顯長于ERCP組(6.03±2.69)d和PTCD組(6.95±3.18)d(P<0.05)；ERCP組與PTCD組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.7 惡性膽管梗阻伴黃疸患者術(shù)后并發(fā)癥 膽腸吻合組16例患者中切口感染1例、消化道出血1例、膽管炎2例，并發(fā)癥發(fā)生率為25.00%；ERCP組29例患者中急性胰腺炎1例，消化道出血1例，均經(jīng)保守治療后好轉(zhuǎn)，并發(fā)癥發(fā)生率為6.89%；PTCD組11例患者中術(shù)后感染1例、脫管1例，并發(fā)癥發(fā)生率為18.18%。ERCP組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于PTCD組和膽腸吻合組，PTCD組明顯低于膽腸吻合組(P<0.05)。

3 討 論

梗阻性黃疸腸黏膜通透性增加可引起細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，引發(fā)多器官損傷和敗血癥，但分子學(xué)機(jī)制仍未明確。腸黏膜屏障由腸黏液層、上皮細(xì)胞和其間隙相連的機(jī)械屏障及免疫系統(tǒng)組成，可阻止腸道中有害物質(zhì)通過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)和組織器官〔4〕。黏蛋白家族中黏蛋白-2是腸黏液層的主要成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，黏蛋白-2參與維持小鼠腸黏膜層，被輪狀病毒感染的小鼠黏蛋白-2 mRNA表達(dá)量明顯增加，以提升抗病毒能力〔5〕。同時(shí)黏蛋白-2數(shù)量或功能降低還可能參與先天性巨結(jié)腸、腸易激綜合征等疾病的發(fā)生、發(fā)展〔6〕。本次研究中惡性膽管梗阻伴黃疸患者存在腸黏膜屏障損傷，而腸道黏液層黏蛋白-2低表達(dá)可能是腸黏膜屏障功能損傷的重要因素。

梗阻性黃疸患者也常伴有腸黏膜屏障受損，但該類患者腸黏膜黏蛋白-2變化的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本次研究提示惡性膽管梗阻性黃疸可損傷黏蛋白-2，影響?zhàn)つて琳?，刺激杯狀?xì)胞分泌大量黏蛋白-2以修復(fù)受損的黏液層，是小腸自我保護(hù)機(jī)制之一。

杯狀細(xì)胞是一種在腸道廣泛分布的單細(xì)胞分泌腺，主要分泌黏蛋白、TFF1等物質(zhì)，在腸黏膜屏障中具有重要作用〔7〕。當(dāng)黏膜受損時(shí)，杯狀細(xì)胞可通過變形、遷移進(jìn)行修復(fù)。本次研究顯示，惡性膽管梗阻性黃疸組杯狀細(xì)胞發(fā)揮復(fù)合胞吐作業(yè)，分泌黏蛋白修復(fù)黏液層，維持屏障功能，但會(huì)降低杯狀細(xì)胞內(nèi)的黏蛋白儲(chǔ)存量，腸黏膜儲(chǔ)備防御功能降低，導(dǎo)致適應(yīng)性保護(hù)下降，再次受到外源性刺激時(shí)，杯狀細(xì)胞難以及時(shí)分泌出足夠的黏蛋白。

晚期惡性梗阻性黃疸患者因受腫瘤生物特性和內(nèi)臟解剖結(jié)構(gòu)的限制，多數(shù)患者確診時(shí)已失去根治術(shù)機(jī)會(huì)。因此需行姑息性治療減輕黃疸癥狀，改善肝功能。目前臨床中主流的姑息治療方法包括Roux-en-Y吻合術(shù)、ERCP、PTCD。本次研究中比較了三種療法對老年晚期惡性梗阻性黃疸患者的治療效果，結(jié)果顯示，三種術(shù)式均能有效減除膽道梗阻，減輕黃疸并在較長時(shí)間內(nèi)維持通暢，在減黃和生存時(shí)間上無明顯差異。但ERCP膽道支架治療的并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于Roux-en-Y吻合術(shù)和PTCD，術(shù)后住院時(shí)間明顯短于Roux-en-Y吻合術(shù)，有效減輕患者痛苦和治療費(fèi)用。

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2 Beyazit Y,Kekilli M,Ibis M,etal.Can red cell distribution width help to discriminate benign from malignant biliary obstruction? A retrospective single center analysis〔J〕.Hepatogastroenterology,2012;59(117):1469-73.

3 Tsauo J,Li X,Li H,etal.Transjugular insertion of bare-metal biliary stent for the treatment of distal malignant obstructive jaundice complicated by coagulopathy〔J〕.Cardiovasc Interv Radiol,2013;36(2):521-5.

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5 Junejo MA,Siriwardena AK,Parker MJ,etal.Peripheral oxygen extraction in patients with malignant obstructive jaundice〔J〕.Anaesthesia,2014;69(1):32-6.

6 Qiu YD,Bai JL,Xu FG,etal.Effect of preoperative biliary drainage on malignant obstructive jaundice:A meta-analysis〔J〕.World J Gastroenterol,2011;17(3):391-6.

7 Yilmaz B,Parildar Z,Bozkaya H,etal.Prognostic utility of serum neopterin in obstructive jaundice secondary to malignant lesions treated by percutaneous transhepatic biliary drainage〔J〕.J Vasc Int Radiol;24(6):865-72.

〔2016-06-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

河北省衛(wèi)生廳青年科技課題(20140810)

劉曉剛(1966-)，男，碩士，教授，主要從事肝膽疾病的診療研究。

R57

A

1005-9202(2017)01-0129-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.057