丁法明 李 娜 宓寶斌 畢麗麗

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

CD36基因多態(tài)性與動(dòng)脈硬化心臟病的相關(guān)性

丁法明 李 娜 宓寶斌 畢麗麗

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

目的 探討動(dòng)脈硬化心臟病與CD36單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系。方法 121例動(dòng)脈硬化心臟病患者及體檢的健康者217例進(jìn)行研究；空腹12 h后采集靜脈血5 ml，檢查甘油三酯、空腹血糖、血細(xì)胞、低密度脂蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白、血栓素B2等主要生化指標(biāo)，記錄其體質(zhì)量、升高、體質(zhì)量指數(shù)、血壓等一般指標(biāo)，并詳細(xì)問(wèn)詢(xún)其疾病史；采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)法(PCR-LDR法)檢測(cè)CD36的 SNPs基因型。結(jié)果 對(duì)照組冠心病、高血壓、糖尿病患者比例及血壓、體質(zhì)量指數(shù)、甘油三酯、血糖、總膽固醇、血栓素、低密度脂蛋白顯著低于病例組(P<0.05)，病例組患者血高密度脂蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；rs1761667位點(diǎn)存GG、AG、AA 3種基因型，兩組基因頻率差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；分析分布頻率發(fā)現(xiàn)，病例組AG基因型顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；AG基因型人群中病例組患者收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，高密度脂蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；AG基因型均可明顯增加動(dòng)脈硬化心臟病的患病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)；甘油三酯、收縮壓、糖尿病史、冠心病史、低密度脂蛋白與rs1761667AG基因型為影響動(dòng)脈硬化心臟病的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素(P<0.05)；CD36 SNPs具有群體代表性，符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。結(jié)論 動(dòng)脈硬化心臟病與CD36 rs1761667的AG型存相關(guān)關(guān)系，是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化心臟病的遺傳因素。

CD36；基因多態(tài)性；動(dòng)脈硬化心臟病

動(dòng)脈硬化心臟病是臨床中常見(jiàn)的嚴(yán)重威脅老年人生命健康及生活質(zhì)量的臨床多發(fā)性疾病，血栓及動(dòng)脈硬化斑塊的形成在動(dòng)脈硬化心臟病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，此外，血脂異常及血小板活化異常又是導(dǎo)致該病發(fā)生的危險(xiǎn)性因素〔1,2〕。雖有學(xué)者指出動(dòng)脈硬化可能與遺傳因素有關(guān)，但現(xiàn)階段尚未表明遺傳因素與動(dòng)脈硬化心臟病存在直接關(guān)系〔3〕。CD36是最早發(fā)現(xiàn)于血小板的糖蛋白屬B族清道夫受體，后由大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其也存在于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，高血脂患者體內(nèi)氧化低密度脂蛋白與CD36特異性結(jié)合，促進(jìn)血小板活化，提高凝血狀態(tài)，加速內(nèi)血栓形成〔5〕。有研究指出，通過(guò)CD36巨噬細(xì)胞可攝取大量氧化低密度脂蛋白并形成泡沫細(xì)胞〔6〕。因而推斷CD36表達(dá)水平與CD36基因多態(tài)性關(guān)系密切，其可能與動(dòng)脈硬化心臟病緊密相關(guān)。本研究分析探討動(dòng)脈硬化心臟病與CD36單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2014年1月至2015年5月我院收治的121例動(dòng)脈硬化心臟病患者作為受試者，女31例，男90例，平均年齡(80.83±3.74)歲。所有患者均經(jīng)彩超、MRI或CT診斷后確診為動(dòng)脈硬化心臟病。同期選取于我院體檢的健康者217例作為對(duì)照組，女42例，男175例，平均年齡(80.29±3.72)歲。兩組一般臨床資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，分組合理，具有可比性。入組患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)患者均未并發(fā)動(dòng)脈炎、血液病、外傷、腫瘤、血管畸形、動(dòng)脈瘤；(2)患者肝腎功能正常，無(wú)發(fā)熱、感染；(3)患者均排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血液?。?4)未使用過(guò)免疫抑制劑；(5)參與本研究前30 d內(nèi)未服用他汀類(lèi)、氯吡格雷、華法林及阿司匹林類(lèi)藥物。

1.3 方法

1.3.1 生化指標(biāo)及一般資料 空腹12 h后采集靜脈血5 ml，使用日立全自動(dòng)生化分析儀檢查患者體內(nèi)甘油三酯、空腹血糖、血細(xì)胞、低密度脂蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白等主要生化指標(biāo)。此外對(duì)有所有入組人員的體質(zhì)量、身高、體質(zhì)量指數(shù)、血壓等一般指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量記錄，詳細(xì)問(wèn)詢(xún)病史，如高血壓史、糖尿病史、冠心病史等。

1.3.2 測(cè)定血漿血栓素B2 使用ELISA法檢測(cè)患者血漿中血栓素B2水平，采集血樣品后離心15 min(1 000 r/min)收集血漿，使用酶聯(lián)免疫試劑盒(Cayman公司，美國(guó))檢測(cè)血栓素B2水平，嚴(yán)格依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 CD36 SNPs檢測(cè) 使用Haploview分析中國(guó)漢族人群CD36的SNPs位點(diǎn)即rs9784998及rs1761667，后采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)法(PCR-LDR法)檢測(cè)CD36的 SNPs基因型。PCR擴(kuò)增：使用Pubmed查詢(xún)r(jià)s9784998及rs1761667的PCR引物序列，并委托上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司合成，以20 μl作為PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增完成后使用瓊脂糖凝膠電泳(3%)檢測(cè)產(chǎn)物。連接酶檢測(cè)：委托上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司合成LDR探針，以10 μl作為L(zhǎng)DR反應(yīng)體系，反應(yīng)完成后取LDR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并使用Genemapper軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0軟件計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)率的比較采用χ2檢驗(yàn)分析Logistic回歸分析相關(guān)性，使用擬合優(yōu)度法檢驗(yàn)基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料及血栓素B2檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組冠心病、高血壓、糖尿病患者比例顯著低于病例組(P<0.05)，且該組血壓、體質(zhì)量指數(shù)、甘油三酯、血糖、總膽固醇、血栓素、低密度脂蛋白均顯著低于病例組(P<0.05)。病例組患者高密度脂蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

指標(biāo)對(duì)照組(n=217)病例組(n=121)P值男性(n)175900.18年齡(歲)80.29±3.7280.83±3.740.21體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)24.07±3.0425.29±3.700.00冠心病史(n)116920.00高血壓史(n)1301010.00糖尿病史(n)36380.00舒張壓(mmHg)76.20±10.9779.46±11.630.01收縮壓(mmHg)144.04±14.93152.10±19.980.00甘油三酯(mmol/L)1.00±0.421.27±0.690.00空腹血糖(mmol/L)5.67±0.976.04±1.510.02低密度脂蛋白(mmol/L)2.82±0.703.10±0.830.00總膽固醇(mmol/L)4.80±0.825.10±1.000.01高密度脂蛋白(mmol/L)1.49±0.371.39±0.380.02血栓素B2(pg/ml)340.36±4.22550.04±4.570.01血小板計(jì)數(shù)(×108/L)184.60±58.76187.60±46.260.64

2.2 CD36基因多態(tài)性結(jié)果 應(yīng)用Genemapper對(duì)兩位點(diǎn)基因分型進(jìn)行分析，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 rs9784998位點(diǎn)分析圖

圖2 rs1761667位點(diǎn)分析圖

2.3 CD36多態(tài)性分布頻率 rs1761667位點(diǎn)存在GG、AG、AA 3種基因型，兩組基因頻率差異顯著(P<0.05)；深入分析分布頻率發(fā)現(xiàn)，病例組AG基因型顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。rs9784998存在TT、CT、CC 3種基因型，但兩組間3種基因型的分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。病例組患者收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，高密度脂蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 CD36 SNPs基因型及分布頻率比較〔n(%)〕

SNPs病例組(n=121)對(duì)照組(n=217)χ2值P值Rs9786998C180(75.63)310(71.43)1.370.24T58(24.37)124(28.57)TT5(4.20)22(10.14)3.700.16CC66(55.46)115(53.00)CT48(40.34)80(36.86)Rs1761667A93(39.08)159(36.81)0.030.86G145(60.92)273(63.19)GG39(32.77)92(42.60)AA13(10.93)35(16.20)7.140.03AG67(56.30)89(41.02)

指標(biāo)對(duì)照組(n=89)病例組(n=67)P值體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)23.40±2.8425.56±3.560.00甘油三酯(mmol/L)0.97±0.411.29±0.670.00收縮壓(mmHg)143.15±13.97151.83±20.450.01舒張壓(mmHg)75.67±1.1879.75±11.750.03低密度脂蛋白(mmol/L)2.80±0.723.09±0.900.03高密度脂蛋白(mmol/L)1.49±0.341.37±0.370.04總膽固醇(mmol/L)4.76±0.825.05±1.030.05血栓素B2(pg/ml)336.97±4.26473.43±4.570.17血小板計(jì)數(shù)(×108/L)182.45±44.85180.06±42.200.74

2.4 rs1761667 SNPs對(duì)動(dòng)脈硬化心臟病影響 調(diào)整性別、冠心病、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、糖尿病、甘油三酯、收縮壓、低密度脂蛋白前后rs1761667，AG基因型可明顯增加動(dòng)脈硬化心臟病的患病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 rs1761667 SNPs對(duì)動(dòng)脈硬化心臟病的影響

基因型對(duì)照組(n=89)病例組(n=67)調(diào)整前OR(95%CI)P值調(diào)整后OR(95%CI)P值A(chǔ)A35130.88(0.42～1.83)0.730.67(0.27～1.62)0.37AG89671.77(1.09～2.90)0.021.93(1.08～3.45)0.03GG92391.00-1.00-

2.5 動(dòng)脈硬化心臟病危險(xiǎn)因素篩選 使用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，甘油三酯、收縮壓、糖尿病史、冠心病史、低密度脂蛋白與rs1761667AG基因型進(jìn)入回歸方程，為影響動(dòng)脈硬化心臟病的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 多元Logistic回歸分析結(jié)果(rs1761667 AG型VS GG型)

危險(xiǎn)因素Wsdfr值OR(95%CI)P值冠心病9.520.3010.932.53(1.40～4.55)0.00收縮壓10.220.0110.031.03(1.01～1.04)0.00低密度脂蛋白6.150.1910.461.58(1.10～2.27)0.01甘油三酯4.930.2610.581.78(1.07～2.95)0.03AG4.710.2910.631.88(1.06～3.34)0.03糖尿病4.930.3110.681.97(1.08～3.59)0.03

2.6 Handy-Weinberg平衡定律檢測(cè)結(jié)果 CD36 SNPs(rs9784998和rs1761667)具有群體代表性符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

3 討 論

人源CD36基因外顯子數(shù)不低于15個(gè)，位于7號(hào)染色體q11.2區(qū)。CD36 cDNA序列結(jié)果顯示，其由471個(gè)氨基酸組成，分子量為88 kD〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，CD36共存2 900個(gè)以上基因多肽位點(diǎn)，且其大部分為SNPs；全基因組研究發(fā)現(xiàn)，CD36 存15個(gè)SNPs，可能增加動(dòng)脈硬化心臟病的患病風(fēng)險(xiǎn)〔8〕。有學(xué)者指出， CD36為巨噬細(xì)胞及血小板上受體，可特異性結(jié)合氧化低密度脂蛋白，而SNPs可改變CD36在靶細(xì)胞上的表達(dá)，提示氧化低密度脂蛋白可能在動(dòng)脈硬化性心臟病的發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色〔9〕。此外，諸多動(dòng)脈硬化疾病可能與CD36 SNPs密切相關(guān)。

本組研究結(jié)果顯示，CD36 rs1761667的AG型可顯著增加動(dòng)脈硬化心臟病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，分析認(rèn)為與其可影響靶細(xì)胞表面CD36表達(dá)水平有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，CD36在不同人種中表達(dá)水平存一定差異，且其可能與rs1761667基因型密切相關(guān)，如AA型人體內(nèi)CD36表達(dá)量最低，而GG與AG型表達(dá)量明顯高于AA型〔10〕。AG型基因頻率在病例組中明顯高于對(duì)照組。分析認(rèn)為其可能導(dǎo)致CD36表達(dá)量增高，導(dǎo)致單核細(xì)胞大量吞噬氧化低密度脂蛋白，最終導(dǎo)致單核細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈硬化病灶區(qū)的形成。有學(xué)者指出，受rs1761667影響，CD36在血小板表面表達(dá)水平可明顯增加，增強(qiáng)血小板活化及聚集水平，加速血栓形成〔11〕。本次研究中在評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)血小板活化水平時(shí)使用血漿血栓素B2作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果顯示病例組患者血栓素B2水平明顯偏高。病例組AG型個(gè)體內(nèi)血栓素B2水平雖有升高趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異，分析認(rèn)為其可能與臨床樣本數(shù)較少或與CD36以外影響血小板活化水平因素有關(guān)。此外，有學(xué)者指出，rs1761667可通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝增高動(dòng)脈硬化心臟病患病風(fēng)險(xiǎn)〔12〕。作為一類(lèi)典型的長(zhǎng)鏈脂肪酸受體，CD36參與游離脂肪酸向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。有學(xué)者研究證實(shí)，rs1761667可使清中游離脂肪酸水平明顯增高，而在動(dòng)脈硬化的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中游離脂肪酸又起著極其重要作用〔13〕。有研究發(fā)現(xiàn)，人體血清中高密度脂蛋白與CD36表達(dá)負(fù)性相關(guān)，低密度脂蛋白與CD36表達(dá)正性相關(guān)〔14〕。本研究結(jié)果顯示，AG型組中病例組低密度脂蛋白水平明顯偏高，低密度脂蛋白水平顯著偏低，與其研究結(jié)果相似。此外，近年來(lái)有研究指出代謝綜合征、2型糖尿病與rs1761667水平密切相關(guān)，可增加患者動(dòng)脈硬化心臟病患病率〔15〕。

綜上所述，動(dòng)脈硬化心臟病與CD36 rs1761667的AG型存相關(guān)關(guān)系，是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化心臟病發(fā)病的遺傳因素。但本次研究臨床樣本數(shù)較少，其是否具有廣泛臨床意義還有待進(jìn)一步研究。

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〔2016-08-09修回〕

(編輯 曲 莉)

山東省自然科學(xué)基金(ZR2014HP024)

宓寶斌(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年常見(jiàn)病的診療工作。

丁法明(1984-)，男，碩士，主要從事冠心病及心律失常的介入治療研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)01-0079-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.034