朵 杰 汪曉洲

(青海省心腦血管病?？漆t(yī)院高血壓科,青海 西寧 810000)

芹菜素與老年大鼠缺血心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

朵 杰 汪曉洲

(青海省心腦血管病專科醫(yī)院高血壓科,青海 西寧 810000)

目的 對(duì)芹菜素與老年大鼠缺血心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(Caspase)-3表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行研究。方法 選取選擇健康的老年大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、心肌缺血再灌注組和不同劑量芹菜素組各10只。制作缺血再灌注模型采用結(jié)扎左冠狀勤脈前降支,心肌缺血30 min,再灌注2 h。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余各組在缺血前10 min股靜脈分別注射生理鹽水、聚乙二醇、低劑量、中劑量、高劑量芹菜素，檢測(cè)缺血心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)。結(jié)果 正常組和假手術(shù)組的凋亡細(xì)胞數(shù)極少；心肌缺血再灌注組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯的增多，芹菜素低劑量(1 mg/kg)組：Apil1、芹菜素中劑量(2 mg/kg)組：Apil2、芹菜素高劑量(4 mg/kg)組：Apil4的凋亡的凋亡細(xì)胞數(shù)下降，其中芹菜素高劑量(4 mg/kg)組：Apil4的凋亡細(xì)胞數(shù)下降明顯。心肌缺血再灌注組的Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR與正常組、假手術(shù)組、芹菜素高、中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芹菜素低劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR與正常組、假手術(shù)組、心肌缺血再灌注組、芹菜素高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芹菜素中劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR與正常組、假手術(shù)組、心肌缺血再灌注組、芹菜素高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且芹菜素低劑量組的Bax、AR與芹菜素中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 芹菜素與缺血心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)存在相關(guān)性，且芹菜素可以減輕心肌損傷。

芹菜素；缺血心肌細(xì)胞；Bcl-2；Bax；Caspase-3

芹菜素是一種存在于植物中的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用〔1〕。芹菜素可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等〔2，3〕。細(xì)胞凋亡與心血管疾病之間存在著較大的聯(lián)系，以往研究認(rèn)為心肌缺血、再灌注損傷時(shí)造成心肌細(xì)胞死亡的形式為壞死，氧化應(yīng)激、負(fù)荷過重等不僅會(huì)造成心肌細(xì)胞的壞死，還可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡〔4，5〕。芹菜素對(duì)心肌缺血、再灌注損傷有保護(hù)作用。本文對(duì)芹菜素和老年大鼠缺血心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(Caspase)-3表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康老年大鼠60只，體重200～250 g，將其隨機(jī)分為6組，正常組、假手術(shù)組、心肌缺血再灌注組、芹菜素低劑量(1 mg/kg)組、芹菜素中劑量(2 mg/kg)組、芹菜素高劑量(4 mg/kg)組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 芹菜素(純度≥98%、陜西慧科植物開發(fā)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：AP20090727)；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Roche公司生產(chǎn))；Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體、SP試劑盒(博奧森林生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；10%甲醛溶液(自制)；生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn))；精密天平(型號(hào)：Sartorious BS124S)，動(dòng)物人工呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：HX-300)；電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)(生產(chǎn)企業(yè)：浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠采用烏拉坦麻醉，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，頸部正中切口，氣管插管，連接呼吸機(jī)。在胸部左側(cè)開胸，人工呼吸頻率60次/min，通氣量20 ml/kg，輕壓胸廓，擠出心臟，左冠狀動(dòng)脈起始下方采用醫(yī)用無損傷縫合針進(jìn)針，1號(hào)絲線穿過冠狀動(dòng)脈前降支下。心臟復(fù)位，穩(wěn)定10 min后，股動(dòng)脈給藥。正常組推注體積容積聚乙二醇(PEG)400和10%無水乙醇，假手術(shù)組穿線后10 min股動(dòng)脈推注等體積生理鹽水4 ml/kg，心肌缺血再灌注組缺血前10 min股動(dòng)脈推注4 ml/kg生理鹽水，芹菜素各劑量組缺血前10 min股動(dòng)脈推注1、2、4 mg/kg芹菜素。正常、假手術(shù)組縫合線空置，其他組10 min之后拉緊縫合線，實(shí)施壓迫結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45 min后，結(jié)扎線放松，進(jìn)行2 h的觀察，并實(shí)施肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖、頸動(dòng)脈血壓觀察。老年大鼠在實(shí)驗(yàn)中，結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)為：左心室前壁發(fā)紺、同步心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段增高。再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)為：左心室前壁由發(fā)紺逐漸紅潤(rùn)、ST段降低1/2。細(xì)胞凋亡標(biāo)記及半定量分析：針對(duì)老年大鼠組織中石蠟包埋的心肌組織，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)帶熒光dUTP缺口末端標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)測(cè)定的細(xì)胞凋亡陽性分布情況，記錄每個(gè)視野中30個(gè)心肌細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，針對(duì)平均陽性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行計(jì)算，并將其作為細(xì)胞凋亡率(AR)。

1.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)測(cè)定 選擇上述石蠟標(biāo)本的相應(yīng)部位，連續(xù)切片5張，采用氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)法進(jìn)行免疫組化染色、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色法檢驗(yàn)，在每一張切片的陽性表達(dá)區(qū)域，選擇10個(gè)無重疊視野，使用圖像分析儀器進(jìn)行分析，記錄光密度值均值。心肌組織切片HE染色之后，對(duì)其心肌組織的病理性損傷改變進(jìn)行觀察分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞凋亡分析 心肌組織細(xì)胞凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，正常的細(xì)胞核染藍(lán)色。正常組和假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)極少；心肌缺血再灌注組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。見圖1。

2.2 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)分析 心肌缺血再灌注組的AR值顯著高于其他組(P<0.05)。芹菜素低劑量組AR顯著高于正常組、假手術(shù)組、芹菜素中、高劑量組(P<0.05)。芹菜素中劑量組AR顯著高于正常組、假手術(shù)組、芹菜素高劑量組(P<0.05)。心肌缺血再灌注組Bcl-2顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，顯著低于芹菜素各劑量組(P<0.05)。芹菜素不同劑量組Bcl-2兩兩差異顯著(P<0.05)，芹菜素高劑量組Bcl-2顯著高于其他組(P<0.05)。心肌缺血/再灌注組Caspase-3顯著高于正常組、假手術(shù)組、芹菜素低劑量(P<0.05)。芹菜素各劑量組Caspase-3均顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，芹菜素不同劑量組Caspase-3兩兩差異顯著(P<0.05)，芹菜素中劑量組Caspase-3顯著高于其他組(P<0.05)。心肌缺血再灌注組的Bax顯著高于其他組(P<0.05)。不同劑量芹菜素組Bax兩兩差異顯著(P<0.05)，芹菜素低劑量組Bax顯著高于正常組、假手術(shù)組、芹菜素高、中劑量組(P<0.05)。正常組和假手術(shù)組Bax顯著低于其他組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡影響(TUNEL,×400)

組別Bcl-2(OD)Bax(OD)Caspase-3(OD)AR(%)正常組0.11±0.013)0.07±0.013)0.05±0.013)0.02±0.013)假手術(shù)組0.12±0.023)0.08±0.013)0.06±0.013)1.22±0.121)3)心肌缺血再灌注組0.23±0.041)2)1.06±0.131)2)0.18±0.021)2)29.78±1.351)2)芹菜素低劑量組0.31±0.031)2)3)0.55±0.111)2)3)0.10±0.011)2)3)22.16±1.141)2)3)芹菜素中劑量組0.34±0.041)2)3)0.32±0.061)2)3)4)0.93±0.021)2)3)15.46±0.571)2)3)4)芹菜素高劑量組0.41±0.051)2)3)4)5)0.12±0.021)2)3)4)5)0.61±0.021)2)3)4)5)6.57±0.551)2)3)4)5)

與正常組比較:1)P<0.05；與假手術(shù)組比較:2)P<0.05；與心肌缺血再灌注組比較:3)P<0.05；與芹菜素低劑量組比較:4)P<0.05；與芹菜素中劑量組比較:5)P<0.05

2.3 心肌組織病理學(xué)分析 正常組和假手術(shù)組心肌纖維著色不均勻，且排列紊亂心肌細(xì)胞呈現(xiàn)大片狀的死亡，界限不清，細(xì)胞核有破裂、溶解、消失現(xiàn)象。芹菜素低劑量和中劑量組心肌纖維著色不均，排列紊亂，且心肌細(xì)胞中水腫，空泡樣改變，細(xì)胞核有濃縮、溶解、消失現(xiàn)象，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。芹菜素高劑量組心肌肌纖維相對(duì)完整，排列較為整齊，著色均勻。細(xì)胞核有濃縮、溶解現(xiàn)象。芹菜素劑量可以依賴性地減輕心肌細(xì)胞損傷的病理學(xué)形態(tài)變化。見圖2。

圖2 各組心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×400)

3 討 論

芹菜素在各種疾病的治療中，尤其是腫瘤疾病、心血管疾病的治療中，有良好的作用〔6〕。芹菜素自身有多種藥理作用，在心肌細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、抗炎等方面有顯著的效果〔7〕。芹菜素是一種在水果、蔬菜中廣泛存在的一種黃酮類化合物，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證明，芹菜素在抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡中起著重要的作用〔8〕。

芹菜素可以擴(kuò)張血管，對(duì)血脂、血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等，將芹菜素用于老年心血管疾病等治療中，有顯著的治療效果〔9，10〕。芹菜素是一種天然的抗氧化劑，其在抗病毒、抗炎、抗腫瘤等方面有顯著的作用，芹菜素可以改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的收縮功能，具有抗心律失常、心肌梗死等作用，可以縮小心肌缺血/再灌注損傷面積，對(duì)心肌缺血/再灌注損傷起到有效的保護(hù)作用〔11，12〕。

細(xì)胞的凋亡受到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，Bcl-2、Bax是兩種凋亡調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞的凋亡中起著關(guān)鍵性的作用，Bcl-2、Bax的高低，與細(xì)胞凋亡存在直接的關(guān)系，Bax升高則會(huì)加速細(xì)胞的凋亡，Bcl-2的升高，則會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡，所以細(xì)胞受到凋亡刺激之后，其生存率受到Bcl-2、Bax的影響。Caspase-3是下游階段中關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，Caspase-3蛋白酶的激活，會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡。

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〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰)

朵 杰(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事心血管疾病研究。

R965

A

1005-9202(2017)01-0054-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.024