姚 遠 汪蓓蕾 王大瑋 陳 皓 郭 剛

(天津醫(yī)科大學內分泌研究所，天津 300070)

Shh信號通路相關基因表達調控甲狀腺功能減退的機制

姚 遠 汪蓓蕾 王大瑋 陳 皓 郭 剛

(天津醫(yī)科大學內分泌研究所，天津 300070)

目的 探討甲狀腺功能減退(甲減)大鼠海馬組織中Shh信號通路信號肽Shh、膜受體Patched-1和核轉錄因子Gli-1的表達及甲減對腦發(fā)育及功能調控影響的分子機制。方法 12只SPF級健康Wistar大鼠按照隨機字數(shù)表法分為對照組和甲減組，每組6只，甲減組經腹腔注射丙基硫氧嘧啶建模，對照組經腹腔注射生理鹽水，測定兩組三碘甲狀腺原氨酸(T3)、T4及促甲狀腺激素(TSH)水平，對比兩組Shh、Patched-1和Gli-1蛋白水平及 mRNA表達。結果 與對照組比較，甲減組大鼠血清T3、T4水平明顯降低，TSH水平明顯升高(P<0.05)。甲減組Shh，Patched-1及 Gli-1蛋白及mRNA表達相比對照組均明顯降低(P<0.05)。結論 甲減腦組織Shh、Patched-1和Gli-1 蛋白水平及mRNA表達明顯降低，導致甲狀腺激素生物學效應降低，為甲狀腺功能減退的臨床治療打下堅實基礎。

甲狀腺功能減退；Shh；Patched；Gli

早期胚胎發(fā)育過程中，Hedgehog信號通路能夠確定胚體極性和影響多種成體附屬物的形成〔1，2〕。脊椎動物的Hedgehog家族包括三個成員Shh、Ihh、Dhh，其中Shh蛋白可以通過Shh信號通路發(fā)揮信號傳遞作用，從而影響細胞分化、器官形成和胚胎發(fā)育〔3，4〕。Shh與其跨膜受體Patched結合后，使細胞膜跨膜蛋白Smo游離和激活；Smo下游分子Gli因子水平升高，然后同DNA結合，從而誘導目的基因的轉錄〔5〕。所以Shh信號通路在機體生長發(fā)育過程中起重要作用。Fagman等〔6〕通過檢測Shh基因缺陷的小鼠，結果發(fā)現(xiàn)甲狀腺發(fā)育和移位的時間延遲，并且形成大部分位于左側的單側甲狀腺，其與同齡對照組一側的甲狀腺大致相等。此結果顯示Shh基因能夠控制甲狀腺后期發(fā)育的對稱性。由此推測Shh信號通路與甲減的發(fā)生有關系。甲減作為一種以基礎代謝率降低為特征的內分泌疾病，心率減慢、精神萎靡、肌肉無力和血壓降低等病理變化可能與大腦海馬結構功能改變或者發(fā)育相關〔7〕。旨在探討甲狀腺功能減退與Shh信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 清潔SPF級健康Wistar大鼠12只，雌雄各半，體重(200.1±20.2)g，北京維通利華實驗動物有限公司購買。買回后的大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1 w，并且沒有懷孕等不良反應，將12只大鼠按照隨機字數(shù)表法分為對照組和甲減組，每組6只。甲減組按1 mg/100 g體重經腹腔注射丙基硫氧嘧啶(Sigma，美國)，連續(xù)4 w；對照組腹腔注射生理鹽水(500 μl/只)。

1.2 標本的采集和制備 將兩組大鼠動脈采血以后做甲狀腺功能檢測。處死大鼠后，將冰上獲得的海馬腦組織放到4℃生理鹽水中，置于-80℃冰箱備用，用于Shh、Patched-1、Gli-1 mRNA的檢測。

1.3 甲狀腺激素水平測定 將采集的血液經過10 000 r/min離心5 min，然后取血清，-80℃保存，備用。三碘甲狀腺原氨酸(T3)、T4、促甲狀腺激素(TSH)水平采用放免法檢測，放免試劑盒購自德國Bayer CLIA試劑盒，具體操作按照說明書進行。

1.4 Shh、Patched-1、Gli-1 mRNA表達的測定 海馬組織總RNA提?。焊鶕?jù)說明書每100 mg大鼠海馬組織加入1 ml Trizol(購自Takara)，通過勻漿儀破碎后37℃孵育5 min。然后再加入0.2 ml氯仿，渦旋振蕩器振蕩15 s后，接著孵育3 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液加入0.2 ml異丙醇，室溫下孵育10 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇沖洗3次。4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，37℃烘箱中干燥10 min。最后將RNA沉淀溶于焦碳酸乙二酯(DEPC)水處理過的去離子水中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。通過逆轉錄反應最后獲得cDNA。

PCR擴增：將樣品預變性5 min，然后進入以下循環(huán)：94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min。經過37℃?zhèn)€循環(huán)以后，72℃延伸10 min。利用SYBR Green(Taraka，美國)熒光染料進行實時定量PCR反應，最終獲得各組樣本標準曲線，分析Ct值。北京生工生物工程有限公司合成各目的基因的引物序列，Shh(156 bp)引物：正義5′-GAACTCCGTGGCGGCCAAATC-3′，反義5′-GTCCAGGAAGGTGAGGAAGTC-3′；Gli-1(110 bp)引物：正義5′-TATGTCAGGGTCCCAGGGTTATG-3′，反義5′-GAGCCCGCTTCTTAGTCAGTTTG-3′；Patched-1(80 bp)引物：正義5′-CCATTTCTTGCCCTTGGTGTTG-3′，反義5′-CCTCTTATTCTGTCCCGTTTCAC-3′。

1.5 Shh，Patched-1，Gli-1分子的測定 通過組織勻漿器將加入RIPA裂解液(購自索萊寶)(含蛋白酶抑制劑PMSF)的海馬腦組織磨勻。4℃將勻漿液12 000 r/min離心15 min，取上清液。利用BCA法(Thermo，美國)測定海馬腦組織總蛋白含量。用微量加樣器加入樣品，保證每孔總蛋白量在20 μg。上層濃縮膠的電泳電壓(80 V)，分離膠電泳電壓(110 V)。當溴酚藍染料前沿到凝膠末端處停止電泳。將海綿、濾紙、激活的聚偏氟乙烯(PVDF)膜、分離膠按照既定的順序排列，PVDF膜與膠、濾紙之間不能出現(xiàn)氣泡。在冰盒中80 V電轉2 h。Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫漂洗。洗滌過后加入5%胎牛血清(BSA)封閉2 h。然后加入三種分子對應的一抗(羊抗大鼠Shh，羊抗大鼠Patched-1，兔抗大鼠Gli-1，1∶200；購自Santa)，4℃搖床孵育過夜。加相應辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(中杉金橋，中國)室溫孵育1 h(1∶5 000)，洗膜后，混合好的化學增強發(fā)光法(ECL)顯色試劑覆蓋印跡膜。利用Image圖像分析系統(tǒng)進行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組血清甲狀腺激素水平比較 與對照組比較，甲減組大鼠血清T3、T4水平明顯降低，TSH水平明顯升高(P<0.05)，說明建模成功。見表1。

組別T3T4TSH對照組0.04±0.01598.38±7.260.45±0.04甲減組0.01±0.01218.37±4.780.96±0.03t/P值31.512/0.00184.624/0.00118.543/0.002

2.2 兩組Shh，Patched-1及Gli-1 mRNA及蛋白含量 甲減組Shh，Patched-1及 Gli-1 mRNA及蛋白表達比對照組明顯降低(P<0.05)，見表2，表3。

組別ShhPatched-1Gli-1對照組1.08±0.321.12±0.461.15±0.45甲減組0.60±0.160.62±0.140.81±0.21t/P值10.964/0.00110.335/0.0176.046/0.019

組別ShhPatched-1Gli-1對照組1.08±0.081.04±0.071.09±0.09甲減組0.34±0.060.32±0.040.41±0.01t/P值20.911/0.00120.339/0.01220.045/0.017

3 討 論

甲減最為有效的治療方法是甲狀腺激素終身替代療法。遵循的基本原則是由低量開始，然后慢慢增加劑量，最后達到有效量后長期維持。但是這需要較長時間才能達到體內激素水平的動態(tài)平衡，而且達平衡以后，部分患者仍然需要終身激素替代治療。所以長時間服藥導致的多種副作用是不可忽視的，嚴重者可能誘發(fā)心絞痛甚至心力衰竭等嚴重癥狀〔8〕。T3是生物界中生物活性最強的甲狀腺激素，T4是T3的主要來源和甲狀腺激素庫的主要存在形式，因此測定血清中T3和T4 的濃度能夠反映出甲狀腺功能的狀態(tài)。作為調節(jié)甲狀腺功能的主要激素，TSH作用于碘代謝的所有環(huán)節(jié)，它可以促進碘的轉運、甲狀腺球蛋白水解、酪氨酸碘化和碘泵活性等。最重要的是TSH能夠調節(jié)T3和T4合成與分泌。當甲狀腺功能改變時，TSH濃度的變化、合成和分泌比 T3和T4 更快，并且更加明顯。所以血清中TSH含量變化是診斷甲減的最主要指標。

本實驗結果顯示，甲減組Shh、Patched-1及 Gli-1的蛋白水平比對照組明顯降低，提示甲減能夠影響Shh信號通路。Farmer等〔5〕指出Shh與其跨膜受體 Patched結合后，使細胞膜跨膜蛋白Smo游離并被激活，Smo下游鋅指家族轉錄因子Gli水平升高，成為轉錄激活因子，與DNA結合，從而誘導目的基因的轉錄。這有助于加深對甲減腦損害分子機制的理解，提示Shh信號通路在甲減腦損害的發(fā)病過程中起到特殊作用。Hasebe等〔9〕發(fā)現(xiàn)大鼠甲減時，這三個基因只有Shh基因的相對表達量具有統(tǒng)計學意義的降低，與本次研究一致。進一步研究提示Shh信號通路在甲減腦損害的發(fā)病過程中起到特殊作用。

綜上所述，甲減時腦組織Shh信號通路mRNA表達水平下調，直接導致了甲狀腺激素的生物學效應降低，造成神經細胞損傷。甲減腦組織Shh mRNA表達水平降低的現(xiàn)象，有助于進一步加深對甲減性腦損傷病理機制的認識，推測可以利用某些激活劑激活Shh信號通路，為甲減的臨床提供新思路。

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3 Dugum M，Hanouneh I，McIntyre T，etal.Sonic hedgehog signaling in hepatocellular carcinoma：a pilot study〔J〕.Mol Clin Oncol，2016；4(3)：369-74.

4 Li C，Du Y，Yang Z，etal.GALNT1-mediated glycosylation and activation of sonic hedgehog signaling maintains the self-renewal and tumor-initiating capacity of bladder cancer stem cells〔J〕.Cancer Res，2016；76(5)：1273-83.

5 Farmer WT，Abrahamsson T，Chierzi S，etal.Neurons diversify astrocytes in the adult brain through sonic hedgehog signaling〔J〕.Science，2016；351(6275)：849-54.

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9 Hasebe M，Ohta E，Imagawa T，etal.Expression of sonic hedgehog regulates morphological changes of rat developing cerebellum in hypothyroidism〔J〕.J Toxicol Sci，2008；33(4)：473-7.

〔2016-04-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

郭 剛(1963-)，男，碩士，研究員，主要從事甲狀腺疾病和糖尿病的分子機制研究。

姚 遠(1990-)，女，在讀碩士，主要從事生物化學與分子生物學方面的研究。

R581.2

A

1005-9202(2017)01-0049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.022