程學(xué)敏 黎海娟 黃 茜 黎麗芳 覃 卿 趙 爽 黃彥峰

(右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠抗氧化能力及細(xì)胞色素 C水平的影響

程學(xué)敏 黎海娟 黃 茜 黎麗芳 覃 卿 趙 爽1黃彥峰1

(右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

目的 觀察綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損害小鼠肝臟抗氧化能力及反映線粒體功能的細(xì)胞色素(Cyt)C釋放調(diào)控的影響。方法 40只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、綠茶多酚低、中、高劑量組(100，150，200 mg·kg-1·d-1)，每組8只，綠茶多酚各劑量組灌胃給予受試液，連續(xù)15 d，第16天起綠茶多酚各劑量組和模型組灌胃給予白酒12 ml/kg，連續(xù)3 d，造成急性肝損傷，酶標(biāo)光度分析檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)，ELISA法檢測(cè)肝細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體Cyt C的表達(dá)水平。 結(jié)果 小鼠急性酒精性肝損傷模型復(fù)制成功，與模型組相比，綠茶多酚高劑量組肝臟指數(shù)、ALT、AST、MDA、胞質(zhì)及線粒體Cyt C水平降低(P<0.05)，T-AOC水平明顯升高(P<0.05)。 結(jié)論 綠茶多酚對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激，阻抑Cyt C釋放有關(guān)。

酒精性肝損傷; 綠茶多酚; 細(xì)胞色素C

大量飲酒可引起器官損害特別是肝臟急性損傷〔1〕。乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷的機(jī)制尚未完全闡明，目前研究顯示，急性酒精性肝損傷的發(fā)病可能與乙醇攝入后其代謝產(chǎn)物引起的肝臟氧化應(yīng)激及肝細(xì)胞凋亡過度等機(jī)制有關(guān)〔2～4〕，尚且仍無特異理想的防治藥物干預(yù)措施，現(xiàn)今一些中藥等天然抗氧化植物成分成為藥物研究熱點(diǎn)〔5,6〕。 廣西依托地域地質(zhì)優(yōu)勢(shì)，盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)綠茶，其中茶多酚、咖啡堿、脂多糖、茶氨酸等可保留鮮葉的85%以上，而綠茶多酚就是綠茶中重要的天然藥效成分之一，以往研究顯示，其具有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心血管疾病、抗氧化等多種藥理作用〔7〕，但其對(duì)酒精性肝損傷的預(yù)防和保護(hù)機(jī)制研究甚少，本研究利用小鼠急性酒精性肝損害動(dòng)物模型，觀察綠茶多酚對(duì)肝臟抗氧化能力及反映線粒體功能的細(xì)胞色素(Cyt)C釋放調(diào)控的影響，探討其對(duì)急性酒精性肝損傷肝臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥品、試劑 市售北京紅星二鍋頭白酒(53°)；綠茶提取物(純度≥98%，由西安市洋東新城匯林生物制品公司提供)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)試試劑盒(批號(hào)20141010)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)試試劑盒(批號(hào)20141010)，丙二醛(MDA)檢測(cè)測(cè)試盒(批號(hào)20141125)，總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20141125)，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測(cè)試試劑盒，小鼠CytC ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20150401)，以上均購自南京建成生物研究所。

1.2 主要儀器 漩渦混勻機(jī)(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)、722型可見光分光光度儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)分析儀、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、超聲粉碎機(jī)(寧波東南儀器有限公司)、水浴恒溫箱等。

1.3 動(dòng)物 雄性昆明種小鼠40只，體重約(20±2)g，右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(桂)2012-0003。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型制備 雄性昆明種小鼠40只，體重約(20±2)g，隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照組、模型組、綠茶多酚低、中、高劑量組，分別給予綠茶多酚100，150，200 mg·kg-1·d-1，每組8只。綠茶多酚各劑量組灌胃(ig)給予受試液，空白對(duì)照組和模型組ig給予同等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)15 d。第16天起，綠茶多酚各劑量組和模型組ig給予北京紅星二鍋頭白酒(53°)12 ml/kg，每天1次，連續(xù)3 d，造成急性肝損傷模型，空白對(duì)照組ig給予同等體積生理鹽水。

1.4.2 指標(biāo)測(cè)定 末次ig 16 h后摘除眼球取血，血液靜置2 h，4 ℃，3 500 r/min離心10 min，取血清留存待測(cè)，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血清ALT、AST等生化指標(biāo)，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

小鼠斷椎處死后稱取尸重，迅速剖腹取出肝臟，用生理鹽水沖除表面血液，準(zhǔn)確稱取肝臟重量，計(jì)算肝指數(shù)，肝指數(shù)=〔肝臟重量(g)/動(dòng)物體重(g)〕×100%。然后按肝臟重量體積比加9倍預(yù)冷生理鹽水制成10%的肝臟組織勻漿，分別做兩種不同處理：10%的肝臟組織勻漿1 500 r/min離心10 min，取肝上清液樣本，待測(cè)MDA和T-AOC，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照按MDA和T-AOC試劑盒使用說明書操作。另取10%的肝臟組織勻漿600 r/min離心15 min，取上清液12 000 r/min再次離心，4 ℃，15 min，上清液為胞質(zhì)，留樣待胞質(zhì)Cyt C測(cè)定。沉淀為線粒體，加入0.1 mol/L Tris-HCl 0.5 ml制備線粒體懸液，使用超聲粉碎機(jī)使線粒體破碎，留樣待線粒體Cyt C測(cè)定。Cyt C測(cè)定嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書步驟進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST的影響 模型組及用藥各組小鼠均表現(xiàn)為反應(yīng)淡漠，行走不穩(wěn)，活動(dòng)減少。與空白對(duì)照組比較，模型組肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST均明顯增高(P<0.01)，表明急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織受到損傷，且有肝臟腫脹現(xiàn)象，造模成功。與模型組比較，綠茶多酚各劑量組肝臟指數(shù)下降(P<0.05)，血清ALT、AST含量均下降(P<0.05)，表明綠茶多酚對(duì)肝細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。見表1。

2.2 綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織MDA及T-AOC的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組肝組織MDA含量升高(P<0.01)，T-AOC水平降低(P<0.01)，說明抗氧化能力降低。與模型組相比，綠茶多酚高劑量組MDA含量降低(P<0.05)，而綠茶多酚低、中劑量組MDA含量無明顯改變(P>0.05)；綠茶多酚各劑量組T-AOC水平均升高(P<0.01)，提示綠茶多酚一定程度上能夠提高肝組織的抗氧化能力，改善肝功能。見表1。

2.3 綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體Cyt C水平的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組肝細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體Cyt C水平升高(P<0.05，P<0.01)，提示Cyt C大量釋放，線粒體功能受到影響。與模型組相比，綠茶多酚中劑量組胞質(zhì)Cyt C水平降低(P<0.05)，綠茶多酚低、中、高劑量組線粒體Cyt C水平降低(P<0.05,P<0.01)，提示Cyt C釋放量減少，線粒體功能部分恢復(fù)。見表1。

組別肝臟指數(shù)(%)AST含量(U/L)ALT含量(U/L)MDA含量(nmol/mgprot)T-AOC含量(U/mgprot)CytC(ng/ml)胞質(zhì)線粒體空白對(duì)照組4.12±0.18161.35±45.5656.67±5.053.29±0.611.20±0.3015.95±0.942.19±0.87模型組5.10±0.672)285.96±49.032)106.82±7.462)5.25±0.952)0.54±0.022)18.65±1.761)5.39±0.982)綠茶多酚低劑量組4.05±0.254)174.52±5.874)62.60±4.024)4.33±0.991.21±0.184)16.94±0.312.97±1.563)綠茶多酚中劑量組4.41±0.233)200.26±33.964)113.31±10.184.46±1.301.23±0.194)16.31±0.983)2.34±0.794)綠茶多酚高劑量組4.24±0.234)96.19±10.324)69.21±7.984)4.05±1.123)1.31±0.354)16.85±1.752.09±0.824)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是急性酒精性肝損傷重要的發(fā)病機(jī)制之一。酒成分乙醇在肝臟內(nèi)經(jīng)過復(fù)雜的代謝過程生成乙醛，與此同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞受損。機(jī)體因具備抗氧化防御系統(tǒng)而原本具有抗氧化能力，但氧自由基的大量產(chǎn)生可以使機(jī)體的抗氧化能力降低，為了反映機(jī)體的抗氧化能力與狀態(tài)及氧自由基的活性，可以采用T-AOC這一指標(biāo)來進(jìn)行衡定和評(píng)價(jià)；不飽和脂肪酸的代謝，因存在大量活性氧和氧自由基的參與，導(dǎo)致產(chǎn)物含有可引起細(xì)胞功能障礙甚至誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡的MDA聚集，因此，MDA含量變化可以反映氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損害強(qiáng)度〔8〕。Cyt C是線粒體氧化呼吸鏈唯一的水溶性球狀蛋白，與線粒體內(nèi)膜的心磷脂結(jié)合，位于線粒體內(nèi)外膜之間的膜間隙，Cyt B和細(xì)胞色素氧化酶之間。Cyt C正常時(shí)不能通過線粒體外膜，但當(dāng)組織發(fā)生氧化應(yīng)激，自由基產(chǎn)生增多，線粒體外膜就會(huì)形成孔道即滲透性轉(zhuǎn)換孔隙(PTP)復(fù)合物，由應(yīng)激下線粒體外膜蛋白聚集而成，調(diào)控重要的促凋亡因子Cyt C的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至發(fā)生細(xì)胞凋亡，即Cyt C的釋放量改變與生物膜的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)密切相關(guān)〔9,10〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)大量乙醇在體內(nèi)氧化代謝時(shí)，肝組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷，會(huì)消耗大量的抗氧化物質(zhì)，肝臟抗氧化能力減弱，難以清除過多的自由基，導(dǎo)致T-AOC降低；線粒體內(nèi)膜、外膜通透性均有增大，引起Cyt C自線粒體膜間大量釋放，足以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡線粒體通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)程序，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過度，同時(shí)血清轉(zhuǎn)氨酶釋放性升高，與肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷甚至導(dǎo)致肝細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的損害關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)提示綠茶多酚對(duì)急性酒精中毒的肝臟具有一定的保護(hù)作用。綠茶多酚藥理活性多樣，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含多酚羥基，易被氧化而提供出H+質(zhì)子，尤其具有強(qiáng)大的抗氧化能力(是Vit C的100倍，Vit E的20倍)〔11,12〕，在本實(shí)驗(yàn)中保護(hù)肝細(xì)胞代謝與功能的可能機(jī)制是其能夠有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，減少肝細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞，抑制Cyt C的釋放，促進(jìn)能量代謝，抑制炎癥反應(yīng)，阻斷細(xì)胞凋亡通路的共同途徑等功能以保護(hù)肝臟。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠防治干預(yù)有效，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值，但研究結(jié)果中綠茶多酚不同劑量對(duì)各效應(yīng)指標(biāo)的影響尚未完全呈現(xiàn)一致性劑量效應(yīng)關(guān)系，因而綠茶多酚對(duì)急性酒精性肝損傷防治干預(yù)的有效劑量和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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〔2016-03-20修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016GXNSFAA380278，2014GXNSFBA118172)；廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KY2015YB229)；廣西高校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410599009)；廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(gxzdsysyy2015207)

趙 爽(1980-)，女，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌病理生理學(xué)研究。 黃彥峰(1977-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及中草藥藥效學(xué)研究。

程學(xué)敏(1994-)，女，主要從事內(nèi)分泌病理生理學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)01-0040-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.017

1 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室