黃 翀 陳艷霞 秦曉華 鄒宏昌 徐承云 徐高四 房向東 涂衛(wèi)平

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 南昌 330006)

全反式維甲酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響及可能機(jī)制

黃 翀 陳艷霞 秦曉華 鄒宏昌 徐承云 徐高四 房向東 涂衛(wèi)平

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 南昌 330006)

目的 探討全反式維甲酸(ATRA)對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響及其在延緩糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化中的可能作用機(jī)制。方法 將體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為七組：A組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、B組(30 mmol/L D-葡萄糖)、C組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、D組(10-7mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、E組(10-6mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、F組(10-5mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、G組(10 μmol/L Y-27632+30 mmol/L高糖)，各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。應(yīng)用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和Ⅳ型膠原的表達(dá)水平；RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞RhoA、ROCK1的表達(dá)水平。結(jié)果 B組RhoA mRNA及ROCK1 mRNA 的表達(dá)較A組顯著升高(P<0.05)，D、E、F組RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA 較B組均表達(dá)減少(P<0.05)，且隨著ATRA濃度的升高呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。G組RhoA mRNA的表達(dá)與B組無(wú)明顯差異，但ROCK1 mRNA 的表達(dá)較B組顯著減少(P<0.05)；直線相關(guān)分析顯示高糖組，D、E、F組RhoA mRNA 與ROCK1 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.854,P=0.030;r=0.895,P=0.016;r=0.883,P=0.020;r=0.867,P=0.025)；ELISA 結(jié)果顯示D、E、F組及G組CTGF、Ⅳ型膠原表達(dá)較B組顯著下降(P<0.05)，且下降程度與ATRA濃度呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。結(jié)論 ATRA在一定濃度范圍內(nèi)可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞外基質(zhì)的合成，延緩腎間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK通路有關(guān)。

高糖；全反式維甲酸；RhoA/ROCK信號(hào)通路；HK-2細(xì)胞

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎臟病(CKD)發(fā)展的最終病理結(jié)果。肌成纖維細(xì)胞(MF)的產(chǎn)生與活化引起細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)多沉積被認(rèn)為是RIF發(fā)生的主要機(jī)制。MF主要通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)而來(lái)，而纖維連接蛋白(FN)、肺纖維化結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和Ⅳ型膠原等均是EMT形成的重要生物標(biāo)記物。近些年研究報(bào)道，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β/smad信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)EMT的形成觸發(fā)RIF的發(fā)生，且RhoA/ROCK信號(hào)通路與TGFβ/smad信號(hào)通路在此過(guò)程中具有平行作用〔1〕。最近研究表明全反式維甲酸(ATRA)可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞FN、層黏連蛋白(LN)的合成而延緩糖尿病腎病(DN)腎臟纖維化的發(fā)生〔2〕。然而，目前ATRA可否通過(guò)Rho/ROCK信號(hào)通路影響高糖誘導(dǎo)的RIF的報(bào)道甚少。本文擬探討ATRA對(duì)CKD保護(hù)性生物學(xué)效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HK-2細(xì)胞株(ATCC細(xì)胞庫(kù))；ATRA、Rho 激酶抑制劑Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美國(guó)Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)HK-2 細(xì)胞株，在適宜環(huán)境下(37℃、5%CO2)待細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%～ 80%融合后接種入6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，待至80% 融合后用無(wú)血清DMEM/F12同步生長(zhǎng)48 h。隨機(jī)將細(xì)胞分為七個(gè)實(shí)驗(yàn)組：A組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、B組(30 mmol/L D-葡萄糖)、C組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、D組(10-7mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、E組(10-6mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、F組(10-5mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、G組(10 μmol/L Y-27632+30 mmol/L高糖且Y-27632提前30 min 加入)，各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3 ELISA法定量檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集干預(yù)48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行稀釋、加樣，讀取波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的OD值，用EXCEL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出各樣品CTGF和Ⅳ型膠原表達(dá)濃度。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 由美國(guó) Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成RhoA、ROCK1、β-actin引物各一對(duì)，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，55℃退火30 s，72℃延伸7 min，共35個(gè)循環(huán)。配制2%瓊脂糖凝膠，PCR 產(chǎn)物電泳儀內(nèi)90 V，30 min完成電泳后在凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列

基因引物序列產(chǎn)物(bp)RhoA正義5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3'356反義5'-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3'ROCK1正義5'-TGATGGCTATTATGGACGAG-3'293反義5'-GGAGCGTTTCCCAAGC-3'β-actin正義5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'434反義5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差分析，t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 高糖和ATRA對(duì)RhoA、ROCK1 mRNA表達(dá)的影響 B組RhoA及ROCK1 mRNA的表達(dá)均較A組明顯升高(P<0.05)，D、E、F組RhoA及ROCK1 mRNA 均較B組的表達(dá)顯著減少(P<0.05)，且與ATRA濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。G組RhoA mRNA的表達(dá)與B組無(wú)明顯差異，但ROCK1 mRNA 的表達(dá)較B組顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示B、D、E、F組RhoA mRNA 與ROCK1 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.854,P=0.030;r=0.895,P=0.016;r=0.883,P=0.020;r=0.867,P=0.025)。

2.3 高糖和ATRA對(duì)CTGF、Ⅳ型膠原表達(dá)的影響 D、E、F組及G組CTGF、Ⅳ型膠原表達(dá)較高糖組均顯著下降(P<0.05)，且下降程度與ATRA濃度相關(guān)。見(jiàn)表2。

組別RhoAmRNAROCK1mRNAA組0.249±0.0070.356±0.009B組0.548±0.0191)0.936±0.0111)C組0.248±0.0020.352±0.011D組0.482±0.0121)2)0.687±0.0091)2)E組0.392±0.0101)2)3)0.384±0.0091)2)3)F組0.276±0.0121)2)3)4)0.257±0.0101)2)3)4)G組0.553±0.0171)0.143±0.0122)

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05；與D組比較:3)P<0.05；與E組比較:4)P<0.05；下表同

圖1 各組RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA 的表達(dá)水平

組別CTGF(ng/ml)Ⅳ型膠原(ng/ml)A組64.656±2.18247.520±0.922B組692.930±6.8961)383.203±8.1231)C組67.056±2.54547.370±0.356D組375.896±6.4381)2)313.883±8.3861)2)E組204.900±5.1181)2)3)226.276±1.5571)2)3)F組134.906±4.7471)2)3)4)151.78±0.6621)2)3)4)G組235.310±5.8891)2)81.893±0.6601)2)

3 討 論

DN是糖尿病全身微血管病變之一，是糖尿病常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。既往研究報(bào)道，腎小球病變是DN發(fā)生的主要原因，而近年發(fā)現(xiàn)腎小管病變和腎間質(zhì)纖維化與DN的預(yù)后有著更為密切的關(guān)系，且國(guó)內(nèi)外研究表明高糖可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，最終道導(dǎo)致RIF的形成〔3,4〕。EMT的發(fā)生涉及多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TGFβ/smad是在介導(dǎo)EMT時(shí)被研究較為廣泛的信號(hào)通路之一。近年有研究認(rèn)為〔1〕，EMT過(guò)程涉及的眾多的信號(hào)通路中，RhoA/ROCK與TGFβ/smad是兩條重要且平行的信號(hào)通路。Raquel等〔5～7〕通過(guò)使用RhoA/ROCK特異性阻斷劑證實(shí)RhoA/ROCK在血管緊張素Ⅱ?qū)е碌腅MT中起關(guān)鍵作用，其機(jī)制可能與Rho激酶抑制劑阻斷了腎臟細(xì)胞外基質(zhì)合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖可通過(guò)RhoA/ROCK通路誘導(dǎo)Ⅳ型膠原的合成，使HK-2細(xì)胞外基質(zhì)累積，進(jìn)而引起腎小管間質(zhì)纖維化。而使用Rho激酶抑制劑后，Ⅳ型膠原的表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組顯著減少，這意味著RhoA/ROCK通路在高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中起重要作用。

ATRA是維生素在體內(nèi)的天然活性衍生物，在細(xì)胞分化和維持內(nèi)環(huán)境方面發(fā)揮著廣泛的效應(yīng)。ATRA是一組核受體家族的配體，通過(guò)激活維甲酸受體(RAR)和維甲酸X受體(RXR)，調(diào)控機(jī)體多種基因的表達(dá)，完成多種生物學(xué)效應(yīng)〔8〕。近年來(lái)ATRA在RIF形成機(jī)制的研究中成為熱點(diǎn)，Zhou等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)ATRA能延緩單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的腎間質(zhì)纖維化，進(jìn)一步的研究表明低表達(dá)的RARα/RARβ與大鼠RIF進(jìn)展中的細(xì)胞外基質(zhì)的積聚相關(guān)，這些均提示RARα/RARβ可成為預(yù)防腎間質(zhì)纖維化新的治療靶點(diǎn)〔10〕。有學(xué)者通過(guò)ATRA作用于糖尿病大鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，ATRA可緩解糖尿病大鼠早期腎臟損傷,并減少細(xì)胞外膠原基質(zhì)的過(guò)度累積,最終延緩腎臟纖維化〔11〕。本研究提示ATRA參與緩解高糖刺激下的腎小管間質(zhì)纖維化；同時(shí)，Person相關(guān)分析結(jié)果推測(cè)ATRA的保護(hù)作用與RhoA/ROCK通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示給予高糖刺激后RhoA mRNA 和ROCK1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，加入ATRA干預(yù)后，其表達(dá)隨ATRA濃度的增加而逐漸減弱。ATRA通過(guò)RhoA/ROCK通路發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-12-30修回〕

(編輯 袁左鳴)

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃(20151BBG70173)

涂衛(wèi)平(1960-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腎間質(zhì)纖維化研究。

黃 翀(1985-)，女，主治醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病防治研究。

R587.2；R965

A

1005-9202(2017)01-0038-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.016