趙 杰 劉 芳

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

千金片對慢性盆腔炎大鼠Th1/2型細(xì)胞因子表達(dá)的影響

趙 杰 劉 芳

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

目的 探討婦科千金片對慢性盆腔炎大鼠子宮組織及血清中輔助性T細(xì)胞(Th)1/2型細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法 選取84只雌性SD大鼠，選取其中72只進(jìn)行慢性盆腔炎大鼠造模，造模后隨機(jī)分為模型組(等量蒸餾水)、假手術(shù)組(等量蒸餾水)、千金片高劑量組(2.08 g/kg千金片)、千金片中劑量組(1.04 g/kg千金片)、千金片低劑量組(0.52 g/kg千金片)及婦炎康組(0.41 g/kg婦炎康)各12只，其余12只作為空白組(等量蒸餾水)。治療21 d后檢測各組大鼠子宮組織及血清Th1/2型細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果 模型組、千金片低、中、高劑量組、婦炎康組的HE染色病理學(xué)評分顯著高于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組、婦炎康組的HE染色病理學(xué)評分顯著低于模型組(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組隨著千金片劑量增加，病理學(xué)評分逐漸降低(P<0.05)；模型組大鼠子宮組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-8水平顯著高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10水平顯著低于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10水平顯著高于模型組(P<0.05)。模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10、干擾素(IFN)-γ、IL-12水平顯著低于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10、干擾素(IFN)-γ、IL-12水平顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 婦科千金片能有效抑制慢性盆腔炎大鼠IL-1β、TNF-α、IL-8水平表達(dá)，增強(qiáng)IL-10表達(dá)，從而達(dá)到抗炎的目的。

婦科千金片；慢性盆腔炎；輔助性T細(xì)胞；細(xì)胞因子

已婚女性由于性生活頻繁、陰道內(nèi)菌群環(huán)境失調(diào)等原因，陰道炎癥以及慢性盆腔炎癥性疾病的發(fā)生率逐漸增多，臨床上可反復(fù)發(fā)生下腹部隱痛，部分患者慢性盆腔炎急性發(fā)作時可導(dǎo)致嚴(yán)重的全身炎癥性癥狀。目前急性期盆腔炎一般采用第二代頭孢類抗生素聯(lián)合抗厭氧菌藥物聯(lián)合治療〔1〕。婦科千金片中含有千金拔、 金櫻根、 穿心蓮等中藥成分，可以顯著改善盆腔炎急性期充血、抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善患者盆腔炎癥〔2〕。但目前對于婦科千金片的作用機(jī)制尚不清楚，本文擬分析千金片對盆腔炎大鼠模型局部免疫平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 選取84只雌性SD大鼠，選取其中72只進(jìn)行慢性盆腔炎大鼠造模，造模后隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、千金片高、中、低劑量組及婦炎康組各12只，其余12只作為空白組。所有大鼠均為SPF級，平均體重(200±20)g，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心〔SCXK(湘)2014-0003〕，所有大鼠喂養(yǎng)于12 h光照、濕度40%～60%、溫度23℃～25℃、自由進(jìn)食進(jìn)水的環(huán)境中。

1.2 造模方法 采用5 ml的注射空針將密度為5×106表皮葡萄球菌、 腸道埃希菌以及淋球菌性支原體混合注入培養(yǎng)瓶中混勻。將尾紗剪切成小塊，與培養(yǎng)液充分混勻。將模型鼠倒立，將紗布塞入子宮內(nèi)，注意觀察有無明顯出血，可局部紗布壓迫止血，大鼠倒置5 min。1次/d，連續(xù)操作4次。假手術(shù)組塞入普通浸入生理鹽水的紗布。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 千金片組的抗感染治療分為不同的給藥濃度，按0.52、1.04、2.08 g/kg靜脈滴注給藥，婦炎康組組按照濃度為0.41 g/kg 給予婦炎康藥液，其余各組均給予生理鹽水注射治療，1次/d，連續(xù) 治療4 w。

1.4 指標(biāo)檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-8、IL-4、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-12，1 500 r/min離心5 min后得到血清，4℃保存待測，以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶，靜置15 min后混勻。大鼠子宮組織經(jīng)過研磨后倍比稀釋為7個濃度，取出板條，除了對照孔外每孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，封板蓋封住，室溫反應(yīng)120 min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，除了空白對照孔，每孔加入檢測液100 μl，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加入底物(50 μl/孔)，避光孵育25 min，加入終止液5 min后測定450 nm處吸光度。蘇木素-伊紅(HE)染色:采用石蠟脫水，微波修復(fù)，檸檬酸緩沖液98℃，5 min，之后采用3%過氧化氫抑制10 min，在50%石蠟二甲苯液中浸蠟10 min，100%石蠟液中浸蠟10 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，HE復(fù)染、脫水(85% 1次、95% 2次、無水酒精二次、無水酒精和二甲苯各半1次、純二甲苯2次),封片、鏡檢。HE染色評分標(biāo)準(zhǔn)：未見炎癥細(xì)胞浸潤計0分；子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞(≤30%)計1分；子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞(>30%)，腺上皮輕度增生，極性排列規(guī)則，計2分；間質(zhì)出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(>30%)，腺上皮增生，極性排列紊亂，計3分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS9.0軟件，計量指標(biāo)采用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色病理學(xué)觀察 空白組和假手術(shù)組大鼠的子宮組織黏膜層、肌層、漿膜層組織清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤及炎性滲出；模型組大鼠子宮組織可見子宮黏膜上皮細(xì)胞大部分壞死脫落，腺體變形、擴(kuò)張、彎曲，間質(zhì)細(xì)胞減少，各層子宮組織結(jié)構(gòu)紊亂、界限不清，可見纖維細(xì)胞增生及大量炎性細(xì)胞浸潤及炎性滲出；隨著千金片劑量增加，大鼠子宮組織較模型組改善顯著。HE染色病理學(xué)評分結(jié)果可見，模型組〔(2.63±0.61)分〕、千金片低〔(2.13±0.57)分〕、中〔(1.64±0.60)分〕、高劑量組〔(0.75±0.42)分〕、婦炎康組〔(0.78±0.35)分〕的HE染色病理學(xué)評分顯著高于空白組(0分)和假手術(shù)組(0分)(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組、婦炎康組的HE染色病理學(xué)評分顯著低于模型組(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組隨著千金片劑量增加，病理學(xué)評分逐漸降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組HE染色病理學(xué)觀察(HE，×200)

2.2 各組大鼠血清中Th1/2細(xì)胞因子的表達(dá)情況 模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10、IFN-γ、IL-12水平顯著低于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10、IFN-γ、IL-12水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠子宮組織中Th1/2細(xì)胞因子的表達(dá)情況 模型組大鼠子宮組織中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10水平顯著低于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表2。

組別IL-1β(μg/L)IL-10(μg/L)IL-8(μg/L)TNF-α(μg/L)IL-4(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)IL-12(pg/ml)空白組149.3±8.975.2±6.2124.8±7.7100.2±7.321.3±5.739.6±5.244.6±7.1假手術(shù)組151.2±9.476.0±7.1125.0±8.5101.5±7.922.6±6.238.5±6.143.2±8.0模型組219.4±11.71)59.3±7.51)198.5±9.21)153.9±8.01)39.2±6.91)26.3±4.11)25.1±5.91)千金片組低劑量205.8±11.01)2)64.2±6.91)2)182.3±8.61)2)139.2±8.31)2)35.4±7.11)2)29.0±3.41)2)30.2±5.71)2)千金片組中劑量187.3±10.81)2)68.7±7.01)2)162.6±9.41)2)131.5±7.61)2)31.7±6.41)2)31.2±3.71)2)34.9±6.21)2)千金片組高劑量172.5±9.61)2)71.1±6.91)2)139.5±8.71)2)122.0±8.91)2)26.2±5.51)2)33.8±5.21)2)38.0±6.51)2)婦炎康組171.9±10.41)2)72.0±5.91)2)138.3±8.11)2)121.4±8.31)2)25.8±5.31)2)34.0±5.41)2)39.2±7.01)2)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

組別IL-1βIL-10TNF-αIL-8空白組249.3±7.270.6±5.4121.4±7.9149.2±8.0假手術(shù)組250.4±8.171.0±6.9120.5±8.0148.7±8.1模型組332.5±15.71)60.2±6.71)167.2±9.91)251.6±9.71)千金片組低劑量313.7±14.01)2)63.2±6.31)2)161.7±8.61)2)232.8±9.41)2)千金片組中劑量287.1±11.61)2)66.9±7.11)2)154.2±7.61)2)215.7±8.91)2)千金片組高劑量264.9±12.01)2)68.5±7.01)2)137.7±8.51)2)176.5±9.31)2)婦炎康組261.8±13.51)2)68.0±5.91)2)135.8±9.01)2)178.3±8.91)2)

3 討 論

盆腔炎性疾病發(fā)病病因尚不清楚，長期的子宮內(nèi)膜炎性損傷、陰道內(nèi)炎癥細(xì)胞的上行性感染以及多次人流導(dǎo)致的宮腔操作等，均為影響盆腔炎發(fā)生的獨(dú)立因素。目前西醫(yī)對于盆腔炎的治療仍然以第二代或者第三代抗生素治療為主，但效果不甚理想，抗生素的靜脈滴注往往需要超過1 w才可見明顯臨床癥狀緩解，且癥狀消失后盆腔炎容易復(fù)發(fā)〔4〕。婦科千金片具有清熱除濕，益氣化瘀的功效，臨床上可用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質(zhì)稠、臭穢、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，特別是對于慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性宮頸炎導(dǎo)致的婦科癥狀具有明顯的療效〔5～7〕。IL-1β、TNF-α、IL-8等細(xì)胞因子參與到了炎癥反應(yīng)的組織損傷過程，而IL-10具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。

盆腔炎對于盆腔結(jié)締組織具有反復(fù)損傷性作用，在相關(guān)炎癥細(xì)胞如IL-6以及TNF-α的作用下，結(jié)締組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，而間質(zhì)成分代償性增生。HE染色結(jié)果，提示在動物模型水平上千金片對于組織損傷的保護(hù)性作用。盆腔炎致病以及介導(dǎo)盆腔結(jié)締組織損傷的細(xì)胞因子包括IL-1、IL-8、TNF-α以及中性粒胞質(zhì)刺激因子等，通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞以及漿細(xì)胞的趨化以及血管損傷作用，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)締組織炎癥性損傷以及修復(fù)過程。抑炎細(xì)胞因子包括IL-4、IL-10等，主要抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用而降低組織損傷程度〔8〕。模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著升高，提示了造模成功；而隨著千金片使用劑量的增加，IL-1β、TNF-α、IL-8呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，同時保護(hù)性細(xì)胞炎癥因子IL-10逐漸上升。千金片中含有的千斤拔、金櫻根、穿心蓮，可以“清熱除濕，益氣化瘀”，調(diào)節(jié)盆腔局部炎癥病變區(qū)域的血流以及微環(huán)境中的免疫平衡，促進(jìn)機(jī)體自身性保護(hù)性炎癥因子的釋放〔9〕，進(jìn)而體現(xiàn)出一定的劑量依賴性，提示了在血清學(xué)水平上千金片的作用效果。組織學(xué)水平也呈現(xiàn)了相似的變化，提示了千金片對于盆腔炎病變組織層面的保護(hù)性作用。TNF-α在細(xì)胞炎癥損傷中通過釋放下游炎癥損傷性因子而加重組織損傷，千金片在這一過程中的作用可能與抑制TNF-α的激活以及淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化作用有關(guān)，進(jìn)而降低下游IL-1β、IL-8的釋放，但其具體信號通路機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探討。

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〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

內(nèi)蒙古教育廳課題(No.NJZY16118)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)課題(No.2015ykdxkjbw23)

劉 芳(1976-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科生殖內(nèi)分泌研究。

趙 杰(1979-)，男，碩士，助理研究員，主要從事輔助生殖技術(shù)研究。

R71

A

1005-9202(2017)01-0032-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.013