曲 虹 厲 泉

(千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

低氧對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子1α和促紅細(xì)胞生成素蛋白表達(dá)的影響

曲 虹 厲 泉

(千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

目的 探討低氧對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和促紅細(xì)胞生成素(EPO)蛋白表達(dá)的影響。方法 體外傳代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，分為正常對(duì)照組(N組)、氯化鈷濃度：50,100,150,200,300 μmol/L(C50、C100、C150、C200、C300組)，MTT檢測(cè)不同濃度氯化鈷對(duì)Müller細(xì)胞活力的影響。免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)、Western印跡和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HIF-1α、EPO蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果 氯化鈷濃度低于200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力不受氯化鈷濃度的影響。從200 μmol/L開始，細(xì)胞活力隨氯化鈷濃度增高而下降。氯化鈷濃度高于50 μmol/L時(shí)，HIF-1α、EPO蛋白免疫染色可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，從50 μmol/L 開始HIF-1α蛋白的表達(dá)隨氯化鈷濃度升高而增加。Western印跡檢測(cè)，EPO蛋白表達(dá)從50 μmol/L開始增高，在150 μmol/L時(shí)達(dá)到高峰，以后逐漸下降。結(jié)論 低氧可引起細(xì)胞活性改變并誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞HIF-1α和EPO蛋白表達(dá)的變化。

低氧誘導(dǎo)因子1α；促紅細(xì)胞生成素；視網(wǎng)膜；Müller細(xì)胞

缺氧性視網(wǎng)膜病變引起神經(jīng)細(xì)胞損傷是視力喪失的重要原因，Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜重要的支持營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)維持視網(wǎng)膜神經(jīng)功能具有重要意義。研究低氧對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響，不僅對(duì)缺氧性視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制有重要意義，同時(shí)也為視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)提供新的思路。本文探討低氧對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 新生牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸購(gòu)自Gibco公司，氯化鈷購(gòu)自Sigma公司；抗鼠低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、促紅細(xì)胞生成素(EPO)單克隆抗體來(lái)自Santa Cruz公司；WIP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為北京博奧森生物技術(shù)公司產(chǎn)品；PV6001免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒和FITC標(biāo)記二抗來(lái)自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞傳代培養(yǎng) 出生5～7 d 的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)Wistar乳鼠(青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),每次5只，75%酒精浸泡處死，剝離視網(wǎng)膜，胰蛋白酶及乙二胺四乙酸消化25 min,過(guò)400 目篩網(wǎng)、離心、棄上清，加含血清培養(yǎng)液(10%血清)吹打數(shù)次以重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml,接種于多聚賴氨酸包被過(guò)夜的塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h第一次換液，之后每3 d換液1次,7～10 d時(shí)細(xì)胞融合達(dá)80%以1∶2方式進(jìn)行傳代。每天用倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程及形態(tài)學(xué)的變化，取第3代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象〔1〕。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 N組(正常對(duì)照組)：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。氯化鈷(C)50，C100，C150，C200，C300組：第3代Müller細(xì)胞培養(yǎng)5 d，換含氯化鈷(氯化鈷終濃度分別為50，100，150，200，300 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光(FITC標(biāo)記)染色 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以每孔2×104個(gè)/ml的密度接種于孔內(nèi)預(yù)置1 cm2蓋玻片的24孔板中，終止培養(yǎng)時(shí)吸出培養(yǎng)液，多聚甲醛固定后取出蓋玻片置于載玻片上。按照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作,分別滴加0.1%TritonX-100、0.3%H2O2、山羊血清、一抗(抗大鼠EPO抗體1∶100，孵育2 h)、二抗(孵育20 min)，DAB顯色，脫水，透明，封片。細(xì)胞免疫熒光(FITC標(biāo)記)染色檢測(cè)HIF-1α蛋白：一抗為抗大鼠HIF-1α抗體，二抗為羊抗兔FITC熒光標(biāo)記(1∶50)，以緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。

1.5 MTT細(xì)胞活性檢測(cè) 96孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞密度2×104/ml，常規(guī)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白調(diào)零。培養(yǎng)液沖洗后每孔加入100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)，溫育4 h后翻板棄去MTT溶液，每孔加200 μl二甲基亞砜，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度值(A值)。MTT被活細(xì)胞攝取后經(jīng)線粒體代謝生成甲臜，線粒體活力越旺盛，甲臜生成越多，吸光度也越高。

1.6 Western印跡檢測(cè)EPO蛋白的表達(dá) 每25 cm2培養(yǎng)瓶加WIP細(xì)胞裂解液500 μl提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度。常規(guī)電泳(每孔加樣20 μl，2 μg/μl)、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入抗大鼠EPO、β-actin抗體(1∶200)、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗(1∶600)孵育，DAB顯色、掃描，Bandscan5.0定量分析，結(jié)果均用β-actin灰度值校正。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá) 每25 cm2培養(yǎng)瓶加WIP細(xì)胞裂解液500 μl提取蛋白，測(cè)定并調(diào)節(jié)各組標(biāo)本蛋白質(zhì)濃度為5 μg/ml；試驗(yàn)設(shè)復(fù)孔6個(gè)，并設(shè)立空白對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔。待測(cè)標(biāo)本包被聚苯乙烯包被板。每孔加入100 μl樣品，置濕盒4℃過(guò)夜，封閉液封閉；每孔加入100 μl洗滌液稀釋的HIF-1α抗體反應(yīng)1 h；洗滌扣干；每孔加入100 μl 1∶1 000 HRP標(biāo)記二抗反應(yīng)1 h；顯色：上述每孔中加入臨時(shí)配制的底物溶液100 μl，室溫避光反應(yīng)20 min，每孔加入50 μl 終止液終止反應(yīng)，λ=495測(cè)定吸光度A值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析,q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞體外培養(yǎng) 傳至第3代時(shí)細(xì)胞穩(wěn)定，呈現(xiàn)較一致的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞扁平，細(xì)胞體積大，細(xì)胞核清晰，核仁明顯，胞質(zhì)豐富，折光暗，可見(jiàn)粗大突起，呈鑲嵌樣排列，細(xì)胞分界不清。見(jiàn)圖1。

圖1 第3代的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞(×200)

2.2 MTT檢測(cè)結(jié)果 N組、C50、C100、C150組間兩兩比較A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(N組：0.82±0.03、C50組：0.81±0.02、C100組：0.81±0.01、C150組：0.80±0.01；P>0.05)。C200組(0.65±0.03)較N組、C50、C100、C150組明顯降低(P<0.01)。C300組A值低于C200組(C300組：0.55±0.02，q=14.07，P<0.01)。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)：N組無(wú)EPO蛋白陽(yáng)性染色，C50組可見(jiàn)蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈黃色著染，C150組呈棕黃色著染，見(jiàn)圖2；細(xì)胞免疫熒光染色：N組無(wú)HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)，氯化鈷濃度>50 μmol/L 各組均呈綠色陽(yáng)性熒光染色，見(jiàn)圖3。

圖2 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞EPO陽(yáng)性表達(dá)(DAB，×400)

圖3 細(xì)胞免疫熒光染色HIF-1α蛋白表達(dá)(FITC標(biāo)記，×400)

2.4 HIF-1α蛋白表達(dá) C50組A值高于N 組(C50組：0.13±0.01，N組：0.04±0.01；q=15.55，P<0.01)。C50、C100、C150、C200、C300各組HIF-1α蛋白表達(dá)隨著氯化鈷濃度的升高而增加(C100組：0.32±0.01、C150組：0.45±0.01、C200組：0.64±0.03、C300組：0.79±0.02；q=30.53，21.37，31.92，25.26；P<0.01)。

2.5 EPO蛋白表達(dá) C50組蛋白表達(dá)高于N組(C50組：0.22±0.01，N組：0.10±0.01；q=17.68，P<0.01)，C50、C100、C150組蛋白表達(dá)隨氯化鈷濃度升高而增加，C150組蛋白表達(dá)到最高峰。C200組蛋白表達(dá)低于C150組(C200組：0.52±0.02，C150組：0.63±0.02，q=15.39；P<0.01)，C200、C300組蛋白表達(dá)隨氯化鈷濃度升高而下降(C300組：0.33±0.02，q=29.46；P<0.01)，但仍均高于N組(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

1～6：N組、C50、C100、C150、C200、C300組圖4 Western印跡法檢測(cè)EPO蛋白的表達(dá)

3 討 論

視網(wǎng)膜組織是對(duì)氧非常敏感的神經(jīng)組織，許多視網(wǎng)膜病變均是由急性或慢性缺血缺氧所致。缺氧性視網(wǎng)膜病變除了引起視網(wǎng)膜血管的改變以外，其病變的主要特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷、變性、凋亡，最終導(dǎo)致視力的喪失。Müller細(xì)胞是存在于視網(wǎng)膜中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元正常功能的維持、損傷修復(fù)、“血-視網(wǎng)膜屏障”形成、 神經(jīng)信號(hào)傳遞均具有重要作用。此外，Müller細(xì)胞在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中也起著重要作用，可分泌多種因子，影響視網(wǎng)膜代謝，參與神經(jīng)細(xì)胞損傷過(guò)程〔2,3〕。缺氧性視網(wǎng)膜病變的研究以往多集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)元的改變上，對(duì)于低氧對(duì)Müller細(xì)胞的影響研究甚少。通過(guò)觀察低氧培養(yǎng)下Müller細(xì)胞功能的改變，可揭示Müller細(xì)胞在缺氧性視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制中的作用。氯化鈷是鈷的重要化合物，鈷在高濃度時(shí)與氧結(jié)合，可阻斷氧感受器與氧結(jié)合，使細(xì)胞在不缺氧的環(huán)境下“感覺(jué)”缺氧，并發(fā)生與低氧相似的一系列反應(yīng)。利用鈷離子這一特性，CoCl2通常被用來(lái)在細(xì)胞培養(yǎng)模擬缺氧環(huán)境〔4〕。本研究顯示氯化鈷在200 μmol/L濃度以下時(shí)，細(xì)胞活力無(wú)改變，而200 μmol/L及以其上濃度就可引起細(xì)胞活力的下降，即為細(xì)胞損傷的表現(xiàn)，并且呈一定的濃度依賴性。

低氧預(yù)適應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗損傷的一種重要內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。研究表明心腦等組織存在著低氧預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象，細(xì)胞感受低氧刺激可改變有關(guān)基因的表達(dá)，以提高細(xì)胞對(duì)損傷的耐受力〔5,6〕。腦低氧預(yù)適應(yīng)可提高腦神經(jīng)細(xì)胞HIF-1α及其下游基因的表達(dá)，這些基因可使細(xì)胞防御功能增強(qiáng)，保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步的損傷，并把這些基因稱之為低氧相關(guān)基因，這些基因包括HIF-1以及HIF-1下游的EPO等靶基因。本文結(jié)果顯示氯化鈷引起的化學(xué)性低氧可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)。常氧條件下細(xì)胞內(nèi)生成的HIF-1α很快降解，此時(shí)雖有mRNA表達(dá)但卻檢測(cè)不到蛋白。低氧時(shí)，HIF-1α生成增加，同時(shí)HIF-1α降解過(guò)程也受到抑制，所以HIF-1α蛋白的表達(dá)水平就明顯增加〔7〕。本文顯示氯化鈷模擬的低氧可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞EPO蛋白的表達(dá)增加，并且在適度的濃度(150 μmol/L)下有最高的表達(dá)。HIF-1α隨著氯化鈷濃度升高而增加，而EPO在150 μmol/L濃度時(shí)達(dá)到高峰后出現(xiàn)了下降。

在以往研究成果的基礎(chǔ)上，我們分析了低氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞HIF-1α、EPO蛋白如此表達(dá)的原因。HIF-1是有雙重作用的因子，在一定條件下，HIF-1可產(chǎn)生抗凋亡的保護(hù)作用，但是超過(guò)一定的量，就會(huì)發(fā)揮促凋亡和促新生血管的作用。在200 μmol/L濃度以下,氯化鈷對(duì)Müller細(xì)胞無(wú)損害，并能誘導(dǎo)HIF-1α、EPO蛋白表達(dá)增加，以往研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有EPO受體，此低氧條件下產(chǎn)生的HIF-1α、EPO 蛋白發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，即產(chǎn)生低氧預(yù)適應(yīng)的作用〔8〕。在200 μmol/L濃度以上時(shí)，Müller細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞活力下降的損害改變，出現(xiàn)了低氧損傷。此時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)隨氯化鈷濃度升高繼續(xù)增加，在這種情況下，可能主要發(fā)揮HIF-1α蛋白的促凋亡作用和促新生血管增生的作用，而不是抗凋亡的保護(hù)作用〔9〕。本文結(jié)果顯示一定程度的低氧可引起視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)反應(yīng)，并可能通過(guò)HIF-1α、EPO蛋白的表達(dá)來(lái)參與視網(wǎng)膜神經(jīng)元的保護(hù)。

1 曲 虹，牛膺筠，黨光福.高濃度葡萄糖對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2007;27(7):3531-3.

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〔2013-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

山東省自然科學(xué)基金(ZR2011HL057；ZR2013HM028)

曲 虹(1973-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事玻璃體視網(wǎng)膜病變研究。

R774

A

1005-9202(2017)01-0029-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.012