曲 虹 厲 泉

(千佛山醫(yī)院，山東 濟南 250014)

低氧對大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞低氧誘導因子1α和促紅細胞生成素蛋白表達的影響

曲 虹 厲 泉

(千佛山醫(yī)院，山東 濟南 250014)

目的 探討低氧對大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞低氧誘導因子(HIF)-1α和促紅細胞生成素(EPO)蛋白表達的影響。方法 體外傳代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞，分為正常對照組(N組)、氯化鈷濃度：50,100,150,200,300 μmol/L(C50、C100、C150、C200、C300組)，MTT檢測不同濃度氯化鈷對Müller細胞活力的影響。免疫細胞化學、細胞免疫熒光檢測、Western印跡和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HIF-1α、EPO蛋白表達的情況。結果 氯化鈷濃度低于200 μmol/L時，細胞活力不受氯化鈷濃度的影響。從200 μmol/L開始，細胞活力隨氯化鈷濃度增高而下降。氯化鈷濃度高于50 μmol/L時，HIF-1α、EPO蛋白免疫染色可見陽性表達。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測，從50 μmol/L 開始HIF-1α蛋白的表達隨氯化鈷濃度升高而增加。Western印跡檢測，EPO蛋白表達從50 μmol/L開始增高，在150 μmol/L時達到高峰，以后逐漸下降。結論 低氧可引起細胞活性改變并誘導視網(wǎng)膜Müller細胞HIF-1α和EPO蛋白表達的變化。

低氧誘導因子1α；促紅細胞生成素；視網(wǎng)膜；Müller細胞

缺氧性視網(wǎng)膜病變引起神經(jīng)細胞損傷是視力喪失的重要原因，Müller細胞是視網(wǎng)膜重要的支持營養(yǎng)細胞，對維持視網(wǎng)膜神經(jīng)功能具有重要意義。研究低氧對視網(wǎng)膜Müller細胞的影響，不僅對缺氧性視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制有重要意義，同時也為視網(wǎng)膜神經(jīng)保護提供新的思路。本文探討低氧對視網(wǎng)膜Müller細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 新生牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸購自Gibco公司，氯化鈷購自Sigma公司；抗鼠低氧誘導因子(HIF)-1α、促紅細胞生成素(EPO)單克隆抗體來自Santa Cruz公司；WIP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒為北京博奧森生物技術公司產(chǎn)品；PV6001免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒和FITC標記二抗來自北京中杉生物技術公司。

1.2 視網(wǎng)膜Müller細胞傳代培養(yǎng) 出生5～7 d 的標準實驗用清潔級Wistar乳鼠(青島市實驗動物和動物實驗中心提供),每次5只，75%酒精浸泡處死，剝離視網(wǎng)膜，胰蛋白酶及乙二胺四乙酸消化25 min,過400 目篩網(wǎng)、離心、棄上清，加含血清培養(yǎng)液(10%血清)吹打數(shù)次以重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105/ml,接種于多聚賴氨酸包被過夜的塑料培養(yǎng)瓶內(nèi),置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h第一次換液，之后每3 d換液1次,7～10 d時細胞融合達80%以1∶2方式進行傳代。每天用倒置顯微鏡對培養(yǎng)細胞的生長過程及形態(tài)學的變化，取第3代細胞為實驗對象〔1〕。

1.3 實驗分組 N組(正常對照組)：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。氯化鈷(C)50，C100，C150，C200，C300組：第3代Müller細胞培養(yǎng)5 d，換含氯化鈷(氯化鈷終濃度分別為50，100，150，200，300 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.4 免疫細胞化學、細胞免疫熒光(FITC標記)染色 實驗細胞以每孔2×104個/ml的密度接種于孔內(nèi)預置1 cm2蓋玻片的24孔板中，終止培養(yǎng)時吸出培養(yǎng)液，多聚甲醛固定后取出蓋玻片置于載玻片上。按照試劑盒實驗步驟操作,分別滴加0.1%TritonX-100、0.3%H2O2、山羊血清、一抗(抗大鼠EPO抗體1∶100，孵育2 h)、二抗(孵育20 min)，DAB顯色，脫水，透明，封片。細胞免疫熒光(FITC標記)染色檢測HIF-1α蛋白：一抗為抗大鼠HIF-1α抗體，二抗為羊抗兔FITC熒光標記(1∶50)，以緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。

1.5 MTT細胞活性檢測 96孔培養(yǎng)板接種細胞密度2×104/ml，常規(guī)設5個復孔，并設立空白調(diào)零。培養(yǎng)液沖洗后每孔加入100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)，溫育4 h后翻板棄去MTT溶液，每孔加200 μl二甲基亞砜，酶標儀570 nm波長處測各孔吸光度值(A值)。MTT被活細胞攝取后經(jīng)線粒體代謝生成甲臜，線粒體活力越旺盛，甲臜生成越多，吸光度也越高。

1.6 Western印跡檢測EPO蛋白的表達 每25 cm2培養(yǎng)瓶加WIP細胞裂解液500 μl提取蛋白，測定蛋白濃度。常規(guī)電泳(每孔加樣20 μl，2 μg/μl)、轉膜、封閉，分別加入抗大鼠EPO、β-actin抗體(1∶200)、辣根過氧化酶標記二抗(1∶600)孵育，DAB顯色、掃描，Bandscan5.0定量分析，結果均用β-actin灰度值校正。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HIF-1α蛋白表達 每25 cm2培養(yǎng)瓶加WIP細胞裂解液500 μl提取蛋白，測定并調(diào)節(jié)各組標本蛋白質濃度為5 μg/ml；試驗設復孔6個，并設立空白對照孔和陰性對照孔。待測標本包被聚苯乙烯包被板。每孔加入100 μl樣品，置濕盒4℃過夜，封閉液封閉；每孔加入100 μl洗滌液稀釋的HIF-1α抗體反應1 h；洗滌扣干；每孔加入100 μl 1∶1 000 HRP標記二抗反應1 h；顯色：上述每孔中加入臨時配制的底物溶液100 μl，室溫避光反應20 min，每孔加入50 μl 終止液終止反應，λ=495測定吸光度A值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析,q檢驗。

2 結 果

2.1 視網(wǎng)膜Müller細胞體外培養(yǎng) 傳至第3代時細胞穩(wěn)定，呈現(xiàn)較一致的細胞形態(tài)，細胞扁平，細胞體積大，細胞核清晰，核仁明顯，胞質豐富，折光暗，可見粗大突起，呈鑲嵌樣排列，細胞分界不清。見圖1。

圖1 第3代的視網(wǎng)膜Müller細胞(×200)

2.2 MTT檢測結果 N組、C50、C100、C150組間兩兩比較A值差異無統(tǒng)計學意義(N組：0.82±0.03、C50組：0.81±0.02、C100組：0.81±0.01、C150組：0.80±0.01；P>0.05)。C200組(0.65±0.03)較N組、C50、C100、C150組明顯降低(P<0.01)。C300組A值低于C200組(C300組：0.55±0.02，q=14.07，P<0.01)。

2.3 免疫細胞化學和細胞免疫熒光檢測 免疫細胞化學染色檢測：N組無EPO蛋白陽性染色，C50組可見蛋白陽性表達呈黃色著染，C150組呈棕黃色著染，見圖2；細胞免疫熒光染色：N組無HIF-1α蛋白陽性表達，氯化鈷濃度>50 μmol/L 各組均呈綠色陽性熒光染色，見圖3。

圖2 視網(wǎng)膜Müller細胞EPO陽性表達(DAB，×400)

圖3 細胞免疫熒光染色HIF-1α蛋白表達(FITC標記，×400)

2.4 HIF-1α蛋白表達 C50組A值高于N 組(C50組：0.13±0.01，N組：0.04±0.01；q=15.55，P<0.01)。C50、C100、C150、C200、C300各組HIF-1α蛋白表達隨著氯化鈷濃度的升高而增加(C100組：0.32±0.01、C150組：0.45±0.01、C200組：0.64±0.03、C300組：0.79±0.02；q=30.53，21.37，31.92，25.26；P<0.01)。

2.5 EPO蛋白表達 C50組蛋白表達高于N組(C50組：0.22±0.01，N組：0.10±0.01；q=17.68，P<0.01)，C50、C100、C150組蛋白表達隨氯化鈷濃度升高而增加，C150組蛋白表達到最高峰。C200組蛋白表達低于C150組(C200組：0.52±0.02，C150組：0.63±0.02，q=15.39；P<0.01)，C200、C300組蛋白表達隨氯化鈷濃度升高而下降(C300組：0.33±0.02，q=29.46；P<0.01)，但仍均高于N組(P<0.01)。見圖4。

1～6：N組、C50、C100、C150、C200、C300組圖4 Western印跡法檢測EPO蛋白的表達

3 討 論

視網(wǎng)膜組織是對氧非常敏感的神經(jīng)組織，許多視網(wǎng)膜病變均是由急性或慢性缺血缺氧所致。缺氧性視網(wǎng)膜病變除了引起視網(wǎng)膜血管的改變以外，其病變的主要特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷、變性、凋亡，最終導致視力的喪失。Müller細胞是存在于視網(wǎng)膜中的神經(jīng)膠質細胞，對神經(jīng)元正常功能的維持、損傷修復、“血-視網(wǎng)膜屏障”形成、 神經(jīng)信號傳遞均具有重要作用。此外，Müller細胞在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中也起著重要作用，可分泌多種因子，影響視網(wǎng)膜代謝，參與神經(jīng)細胞損傷過程〔2,3〕。缺氧性視網(wǎng)膜病變的研究以往多集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)元的改變上，對于低氧對Müller細胞的影響研究甚少。通過觀察低氧培養(yǎng)下Müller細胞功能的改變，可揭示Müller細胞在缺氧性視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制中的作用。氯化鈷是鈷的重要化合物，鈷在高濃度時與氧結合，可阻斷氧感受器與氧結合，使細胞在不缺氧的環(huán)境下“感覺”缺氧，并發(fā)生與低氧相似的一系列反應。利用鈷離子這一特性，CoCl2通常被用來在細胞培養(yǎng)模擬缺氧環(huán)境〔4〕。本研究顯示氯化鈷在200 μmol/L濃度以下時，細胞活力無改變，而200 μmol/L及以其上濃度就可引起細胞活力的下降，即為細胞損傷的表現(xiàn)，并且呈一定的濃度依賴性。

低氧預適應是機體對抗損傷的一種重要內(nèi)源性保護機制。研究表明心腦等組織存在著低氧預適應現(xiàn)象，細胞感受低氧刺激可改變有關基因的表達，以提高細胞對損傷的耐受力〔5,6〕。腦低氧預適應可提高腦神經(jīng)細胞HIF-1α及其下游基因的表達，這些基因可使細胞防御功能增強，保護細胞免受進一步的損傷，并把這些基因稱之為低氧相關基因，這些基因包括HIF-1以及HIF-1下游的EPO等靶基因。本文結果顯示氯化鈷引起的化學性低氧可誘導視網(wǎng)膜Müller細胞HIF-1α蛋白的表達。常氧條件下細胞內(nèi)生成的HIF-1α很快降解，此時雖有mRNA表達但卻檢測不到蛋白。低氧時，HIF-1α生成增加，同時HIF-1α降解過程也受到抑制，所以HIF-1α蛋白的表達水平就明顯增加〔7〕。本文顯示氯化鈷模擬的低氧可以誘導視網(wǎng)膜Müller細胞EPO蛋白的表達增加，并且在適度的濃度(150 μmol/L)下有最高的表達。HIF-1α隨著氯化鈷濃度升高而增加，而EPO在150 μmol/L濃度時達到高峰后出現(xiàn)了下降。

在以往研究成果的基礎上，我們分析了低氧誘導視網(wǎng)膜Müller細胞HIF-1α、EPO蛋白如此表達的原因。HIF-1是有雙重作用的因子，在一定條件下，HIF-1可產(chǎn)生抗凋亡的保護作用，但是超過一定的量，就會發(fā)揮促凋亡和促新生血管的作用。在200 μmol/L濃度以下,氯化鈷對Müller細胞無損害，并能誘導HIF-1α、EPO蛋白表達增加，以往研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜感光細胞和神經(jīng)節(jié)細胞均有EPO受體，此低氧條件下產(chǎn)生的HIF-1α、EPO 蛋白發(fā)揮其對細胞的保護作用，即產(chǎn)生低氧預適應的作用〔8〕。在200 μmol/L濃度以上時，Müller細胞出現(xiàn)了細胞活力下降的損害改變，出現(xiàn)了低氧損傷。此時HIF-1α蛋白表達隨氯化鈷濃度升高繼續(xù)增加，在這種情況下，可能主要發(fā)揮HIF-1α蛋白的促凋亡作用和促新生血管增生的作用，而不是抗凋亡的保護作用〔9〕。本文結果顯示一定程度的低氧可引起視網(wǎng)膜Müller細胞內(nèi)源性保護反應，并可能通過HIF-1α、EPO蛋白的表達來參與視網(wǎng)膜神經(jīng)元的保護。

1 曲 虹，牛膺筠，黨光福.高濃度葡萄糖對視網(wǎng)膜Müller細胞超微結構和低氧誘導因子-1α表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2007;27(7):3531-3.

2 Yu J,Zhong Y,Cheng Y,etal.Effect of high hydrostatic pressure on the expression of glutamine synthetase in rat retinal Müller cells cultured in vitro〔J〕.Exp Ther Med，2011;2(3):513-6.

3 Zheng Y,Zeng H,She H,etal.Expression of peptide NAP in rat retinal Müller cells prevents hypoxia-induced retinal injuries and promotes retinal neurons growth〔J〕.Biomed Pharmacother,2010;64(6):417-23.

4 Jin W,Wang J,Xu S,etal.Radioprotective effect on HepG2 cells of low concentrations of cobalt chloride:induction of hypoxia-inducible factor-1 alpha and clearance of reactive oxygen species〔J〕.J Radiat Res,2013;54(2):203-9.

5 Yang L,Fan M,Du F,etal.Hypoxic preconditioning increases iron transport rate in astrocytes〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1822(4):500-8.

6 Park HK,Seol IJ,Kim KS.Protective effect of hypoxic preconditioning on hypoxic-ischemic injured newborn rats〔J〕.J Korean Med Sci,2011;26(11):1495-500.

7 Vadlapatla RK,Vadlapudi AD,Mitra AK.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1):a potential target for intervention in ocular neovascular diseases〔J〕.Curr Drug Targets,2013;14(8):919-35.

8 Giusti S,Fiszer de Plazas S.Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves upregulation of hypoxia-inducible factor-1 in a prenatal model of acute hypoxia〔J〕.J Neurosci Res,2012;90(2):468-78.

9 Mc Laren AT,Marsden PA,Mazer CD,etal.Increased expression of HIF-1alpha,nNOS and VEGF in the cerebral cortex of anemic rats〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2007;292(1):403-14.

〔2013-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

山東省自然科學基金(ZR2011HL057；ZR2013HM028)

曲 虹(1973-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事玻璃體視網(wǎng)膜病變研究。

R774

A

1005-9202(2017)01-0029-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.012