梁 勇 顏麗萍 蘇 林 李 弘 閆玉棟

(桂林市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 桂林 541000)

枯草桿菌二聯(lián)活菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的作用及機(jī)制

梁 勇 顏麗萍 蘇 林 李 弘 閆玉棟

(桂林市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 桂林 541000)

目的 探討枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊(美常安)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠結(jié)腸促炎癥性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和細(xì)胞黏附分子CD44表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法 采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法灌腸建立UC大鼠模型。將SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、美常安治療組。觀察各組疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分(HPS)。造模及美常安干預(yù)7 d后處死大鼠，取結(jié)腸行HE染色，觀察鏡下結(jié)腸病理變化。RT-PCR 法檢測(cè)各組大鼠腸黏膜細(xì)胞因子IL-1β mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織中黏附分子CD44的含量。結(jié)果 模型組較正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜可見膿性分泌物、糜爛及潰瘍，美常安干預(yù)后顯著改善UC大鼠結(jié)腸黏膜的病理變化，DAI和HPS評(píng)分下降顯著，并明顯降低UC大鼠IL-1β mRNA和CD44的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 枯草桿菌二聯(lián)活菌可能通過下調(diào)UC大鼠IL-1β mRNA和CD44的表達(dá)而發(fā)揮干預(yù)作用。

潰瘍性結(jié)腸炎；枯草桿菌二聯(lián)活菌(美常安)；白細(xì)胞介素-1β；黏附因子CD44

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)作為腸道炎癥性疾病其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，病變主要始于左側(cè)結(jié)腸，以連續(xù)方式向結(jié)腸近端乃至全結(jié)腸逐漸發(fā)展，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和黏液膿血便〔1〕。研究指出，細(xì)胞因子和黏附分子與UC的發(fā)病息息相關(guān)，可作為檢測(cè)UC發(fā)展程度的重要指標(biāo)〔2〕。同時(shí)有研究報(bào)道，UC的發(fā)生與腸道菌群具有顯著相關(guān)性〔3〕。雖然枯草桿菌二聯(lián)活菌治療UC的療效已得到充分肯定，但機(jī)制并未完全闡明。本研究采用枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊(美常安)治療UC大鼠，檢測(cè)腸黏膜組織中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和黏附分子CD44的變化，旨在從細(xì)胞水平探討枯草桿菌二聯(lián)活菌對(duì)UC的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 美腸安購于北京韓美藥品有限公司，主要成分為枯草桿菌和糞腸球菌；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)；RT-PCR儀器及其相關(guān)酶和緩沖液(美國Roche公司)。

1.2 藥物劑量 將1粒美腸安膠囊去殼后用16 ml生理鹽水溶解，配成溶液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物模型的制備與分組 用經(jīng)典的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法制作模型，造模結(jié)束后，挑取5只大鼠處死，當(dāng)觀察到結(jié)腸黏膜充血水腫后，對(duì)其作病理切片，驗(yàn)證結(jié)腸黏模發(fā)生損傷、糜爛，說明造模成功。將SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組20只，其余40只大鼠按上述方法造模，證造模成功后，第20天開始將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(n=18)和美常安治療組(n=17)。正常對(duì)照組大鼠以2 ml生理鹽水灌腸，其余兩組用5%乙酸1.0 ml灌腸。2 d后，正常對(duì)照組和模型組每日用生理鹽水2 ml灌胃；美常安治療組用美常安溶液2.5 ml灌胃1次/d，12.5 g/kg；7 d后禁食24 h，處死大鼠，剖開腹部，于病變最嚴(yán)重的部位剪取約1 cm的結(jié)腸組織，剖開，固定于10%甲醛溶液中，分別采用80%、90%、95%、100% 乙醇進(jìn)行梯度洗脫，加入二甲苯進(jìn)行透明處理后，進(jìn)行石蠟包埋切片。

1.4 結(jié)腸組織中黏附分子CD44含量測(cè)定 UC大鼠取病變組織1 cm置于0.9%生理鹽水中，-25℃冰箱保存?zhèn)溆?。取出解凍，將鹽水沖洗干凈的結(jié)腸組織使用勻漿組織破碎儀粉碎至勻漿狀。接著加入20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，用槍打散勻漿后，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到潔凈EP管內(nèi)。2 500 r/min離心沉淀3～5 min，再用PBS沖洗3次，3次低速離心(500～800 r/min)去除細(xì)胞碎片，然后用30目尼龍網(wǎng)將絮狀團(tuán)塊過濾掉，獲得澄澈細(xì)胞懸液。采用流式細(xì)胞術(shù)，嚴(yán)格按照規(guī)定的操作方法和步驟檢測(cè)CD44含量。

1.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-1β mRNA的表達(dá) 采用mRNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總mRNA，儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱。取總mRNA，利用RT-PCR將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過基因庫查詢出IL-1β的引物序列：上游5′-ACC TTCCAGGATGAGGACATGA-3′，下游5′-GATTCTTTCCTTTGAGGCCCA-3′。采用經(jīng)典的PCR技術(shù)行基因擴(kuò)增，檢測(cè)各組IL-1β mRNA相對(duì)含量。

1.6 癥狀和體征觀察及評(píng)分 造模過程中，每天定時(shí)觀察各組小鼠的體重變化、大便狀態(tài)以及便血情況，參照Cooper的經(jīng)典評(píng)分系統(tǒng)，根據(jù)每組小鼠各種癥狀和體征變化進(jìn)行評(píng)分計(jì)算，作為DAI。

1.7 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分(HPS) 選取距肛門2.0 cm以上的結(jié)腸100倍顯微鏡下觀察。根據(jù)炎癥和潰瘍對(duì)結(jié)腸黏膜損傷情況進(jìn)行大致評(píng)分。潰瘍形成及炎癥：無癥狀為0分，輕微充血無潰瘍形成為1分，輕微潰瘍?yōu)?分，潰瘍合并炎癥為3分，嚴(yán)重潰瘍合并炎癥為4分，5分是>2處潰瘍和炎癥>1 cm，6～8分為潰瘍和炎癥>2 cm。留取結(jié)腸標(biāo)本分別用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠DAI評(píng)分情況 UC模型組大鼠開始出現(xiàn)逐漸加重的黏液狀稀便；飼養(yǎng)1 d后，大便次數(shù)開始增多，發(fā)現(xiàn)大便末端有黏液或膿點(diǎn)等現(xiàn)象；造模3 d后，大鼠的糞便全部變成了稀便，有部分大鼠出現(xiàn)便中帶血；5 d左右模型大鼠飲食明顯減少，體重下降顯著，精神萎靡。正常對(duì)照組大鼠大便、體重、毛發(fā)光澤度和活力等均正常。美常安治療組大鼠與模型組同期相比，食欲不振、便血和毛發(fā)干枯等癥狀都有不同程度的緩解。造模第7天。模型組的DAI(6.80±2.33)明顯高于對(duì)照組(0.38±0.14)，而美常安干預(yù)后DAI明顯緩解(4.13±1.80)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理表現(xiàn)(HE，×100)

2.2 各組大鼠HPS評(píng)分情況 見圖1。顯微鏡下，模型組大鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯，黏膜充血水腫清晰可見，潰瘍和炎癥范圍擴(kuò)大，黏膜糜爛和膿腫形成，腺管排列紊亂，HPS評(píng)分(3.54±0.35)分明顯高于對(duì)照組(0.66±0.79)(P<0.05)。美常安干預(yù)后，HPS評(píng)分(1.05±0.49)較模型組下降明顯。

2.3 各組結(jié)腸組織中IL-1β mRNA及CD44表達(dá)比較 與正常對(duì)照組(0.04±0.02，8.64±1.81)相比，模型組IL-1β(0.24±0.06)和CD44(14.74±1.41)的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而美常安干預(yù)后兩者表達(dá)量下降顯著(0.07±0.03，10.23±1.37，P<0.05)。

3 討 論

細(xì)菌在腸道炎癥發(fā)生發(fā)展中起到了極為關(guān)鍵的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)腸的微生物濃集區(qū)域恰好是UC患者發(fā)生炎癥常見的部位〔4〕。因此，腸道共生菌群的作用逐漸引起大家重視并在此方面尋求突破，設(shè)想以枯草桿菌二聯(lián)球菌為代表的益生菌及其產(chǎn)物治療UC的策略順勢(shì)而生。

IL-1β是一種主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物活性并能作用于體內(nèi)多種組織和器官的多肽類細(xì)胞因子，在炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是UC 發(fā)病的重要原因之一〔5〕，因其可趨化炎癥因子進(jìn)入結(jié)腸組織，引起腸道部位發(fā)生諸如結(jié)腸上皮組織損傷、小血管炎、隱窩膿腫等的病變，還能反饋性地促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2等進(jìn)而加速炎癥進(jìn)程，協(xié)同促進(jìn)炎癥反應(yīng)，最終造成UC的發(fā)病〔6〕。有文獻(xiàn)報(bào)道從UC患者結(jié)腸黏膜中檢測(cè)到吞噬細(xì)胞中IL-1β表達(dá)異常升高，且與臨床癥狀嚴(yán)重程度基本一致〔7〕。

細(xì)胞黏附分子作為一類位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白分子，其與UC的關(guān)系同樣引起大家的重視。它能介導(dǎo)細(xì)胞黏附、趨化淋巴細(xì)胞歸巢等參與炎癥和免疫反應(yīng)〔8〕。細(xì)胞表面黏附分子CD44又被稱為吞噬細(xì)胞膜糖蛋白，在淋巴細(xì)胞成熟和歸巢過程中起重要作用，并在正常淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，在內(nèi)皮細(xì)胞弱表達(dá)，但在結(jié)腸及上皮細(xì)胞中不表達(dá)〔9〕。有研究報(bào)道，在正常生理情況下，炎癥反應(yīng)開始時(shí)伴隨CD44表達(dá)的升高，炎癥細(xì)胞與靶細(xì)胞黏附增加，而當(dāng)炎癥反應(yīng)結(jié)束后，二者黏附性隨即減弱，使損傷的組織逐漸恢復(fù)正?！?0〕。然而當(dāng)發(fā)生潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)，CD44的表達(dá)不隨炎癥反應(yīng)結(jié)束而減少，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞與靶細(xì)胞的黏附無法正常終止，炎癥消退減慢或炎癥的持續(xù)存在，最終表現(xiàn)為持續(xù)的組織損傷〔11〕。

美常安是含有枯草桿菌和糞腸球菌的益生菌制劑，具有顯著的生物奪氧功能?？莶輻U菌能夠暫時(shí)定植于腸內(nèi)部位，降低局部組織的氧濃度和氧還原電位，營造出適合厭氧的正常腸道優(yōu)勢(shì)菌群生長的環(huán)境。糞腸球菌與枯草桿菌的結(jié)合可使前者在消化系統(tǒng)的存活率顯著提高，進(jìn)而發(fā)揮最大的生物學(xué)效應(yīng)〔12〕。本研究說明美常安干預(yù)顯著改善了UC模型大鼠的臨床癥狀和結(jié)腸炎癥反應(yīng)，效果顯著。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，在UC發(fā)病機(jī)制中可能是促炎因子IL-1β表達(dá)增多、作用增強(qiáng),再加上黏附分子CD44的活性持續(xù)存在，二者協(xié)同產(chǎn)生一個(gè)異常的免疫應(yīng)答反應(yīng),最終導(dǎo)致UC發(fā)病。IL-1β和CD44很可能是發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，美腸安通過提高腸道減少的有益菌群，增強(qiáng)腸道黏膜屏障，抑制腸黏膜中促炎因子IL-1β和黏附分子CD44的表達(dá),從而減輕腸黏膜的炎癥反應(yīng)，起到治療UC的作用。

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〔2016-04-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(No.Z2014269)

梁 勇(1968-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病研究。

R57

A

1005-9202(2017)01-0027-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.011