金曄華 徐劃萍 金國(guó)琴 蔣嘉曄 龔張斌

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，上海 201203)

補(bǔ)腎健脾方對(duì)地塞米松誘導(dǎo)大鼠骨骼肌萎縮的影響

金曄華 徐劃萍 金國(guó)琴 蔣嘉曄1龔張斌

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，上海 201203)

目的 探討補(bǔ)腎健脾方對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮的保護(hù)作用機(jī)制。方法 將24只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組、美雄酮組。在預(yù)設(shè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行體質(zhì)量稱量，第14天測(cè)試大鼠跑臺(tái)能力，第15天采用多功能生理儀檢測(cè)大鼠肌張力，光鏡檢測(cè)肌纖維橫截面；采用Western印跡方法檢測(cè)骨骼肌肌球蛋白重鏈(Myhc)、肌肉環(huán)狀指基因(MuRF)-1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與正常組比較，模型組的體重、有氧運(yùn)動(dòng)能力、肌張力、Myhc表達(dá)顯著下降，MuRF-1表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、美雄酮組的體重、有氧運(yùn)動(dòng)能力、肌張力、Myhc表達(dá)顯著升高，MuRF-1表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 補(bǔ)腎健脾方能有效抑制蛋白質(zhì)的分解代謝，從而延緩地塞米松誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮。

骨骼肌萎縮；糖皮質(zhì)激素；補(bǔ)腎健脾；泛素化

80歲以上人群中，超過50%患有衰老性骨骼肌萎縮〔1〕，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，并可誘發(fā)其他系統(tǒng)的衰退。研究表明，增齡性的糖皮質(zhì)激素(GC)水平異常升高與骨骼肌萎縮呈正相關(guān)。骨骼肌蛋白降解增加和(或)合成減少是骨骼肌萎縮的主要原因〔2〕。泛素-蛋白酶體通路(UPS)激活可導(dǎo)致靶蛋白泛素化水平增高〔3〕，是GC誘導(dǎo)骨骼肌蛋白降解的主要機(jī)制之一。骨骼肌萎縮在中醫(yī)學(xué)中歸為“痿證”，病機(jī)多為脾腎虧虛，臨床上應(yīng)用補(bǔ)腎健脾法延緩肌肉萎縮常獲良效〔4〕，但其具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究探討中藥補(bǔ)腎健脾方是否能通過調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化水平從而延緩GC誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性Sprauge-Dawley(SD)大鼠24只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(300±20)g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)條件：溫度18℃～22℃，光暗周期12 h∶12 h。

1.1.2 主要藥物與試劑 補(bǔ)腎益氣方：熟地黃(河南)、炙黃芪(內(nèi)蒙古)、潞黨參(山西)、淫羊藿(河南)、炒白術(shù)(浙江)，購(gòu)自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司。水煎2次，濃縮成劑，終濃度為2 mg生藥/ml，-20℃保存。小鼠抗大鼠Myhc等購(gòu)自Millipore公司，兔抗大鼠MuRF-1單克隆抗體等購(gòu)自Abacm公司。

1.1.3 主要儀器 XR-PT-10A小動(dòng)物跑臺(tái)，上海欣軟信息科技有限公司；RM6240多道生理記錄儀，成都儀器廠；BIO-RAD電泳儀及轉(zhuǎn)膜槽，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，采用組間比較法隨機(jī)分組：①正常對(duì)照組(正常組)，②地塞米松模型組(模型組)，③模型+補(bǔ)腎益氣組(中藥組)，④模型+美雄酮組(美雄酮組)，每組6只。模型組、中藥組、美雄酮組大鼠按1 mg·kg-1·d-1腹腔注射地塞米松注射液，連續(xù)14 d。正常組予生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 動(dòng)物給藥及稱重 中藥組按臨床成人每公斤體質(zhì)量劑量的7倍計(jì)算，進(jìn)行灌胃；美雄酮組按每天1 ml/100 g劑量進(jìn)行美雄酮灌胃，連續(xù)14 d。正常組及模型組予以生理鹽水灌胃。分別在第1，7，11天稱量各大鼠的體質(zhì)量。

1.2.3 動(dòng)物腓腸肌最大收縮力測(cè)試 造模結(jié)束后24 h內(nèi)，4%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，連接RM6240多道生理記錄儀，以強(qiáng)度遞增刺激模式檢測(cè)大鼠右下肢腓腸肌最大收縮力。

1.2.4 大鼠腓腸肌蘇木素-伊紅(HE)染色形態(tài)學(xué)檢測(cè)及肌纖維橫截面積的測(cè)量 分離大鼠左下肢腓腸肌，切取1 cm3大小的腓腸肌組織，浸入4%多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片。HE染色后，采用LEICA圖像采集系統(tǒng)選取4個(gè)視野進(jìn)行拍片，放大倍數(shù)為400倍。每個(gè)視野選取20個(gè)肌纖維，應(yīng)用SPOT軟件計(jì)算出每個(gè)肌纖維的橫截面積。

1.2.5 Western印跡法檢測(cè)肌肉環(huán)狀指基因(MuRF)-1、骨骼肌肌球蛋白重鏈(Myhc)蛋白表達(dá) 稱取100 mg腓腸肌組織放入無菌Eppendorf管中，低溫下超聲勻漿，12 000 r/min×10 min離心取上清，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。配8%膠，行十二烷基硫酸鈉-聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉，加一抗，4℃過夜，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(PBST)漂洗4次，二抗孵育，37℃搖床45 min，PBST漂洗4次?；瘜W(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)目標(biāo)條帶。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，每個(gè)樣本重復(fù)6次。一抗工作濃度：抗MuRF-1及抗Myhc均為1∶2 000。Western條帶應(yīng)用灰度分析軟件進(jìn)行光密度計(jì)算。以目的蛋白/GAPDH灰度值比值作為目的蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件行One way anova檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)體重的變化 造模結(jié)束時(shí)，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。正常組大鼠體重穩(wěn)定增加；與正常組〔(19.25±1.605)g〕比較，模型組大鼠在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的體重明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和美雄酮組在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的體重差異不明顯(P>0.05)，也呈持續(xù)下降狀態(tài)。見圖1。

2.2 各組大鼠右下肢骨骼肌最大收縮力的變化 與正常組〔(19.75±1.605)g〕比較，模型組大鼠的最大收縮力〔(11.95±1.377)g〕明顯降低；與模型組比較，中藥組〔(18.50±2.618)g〕與美雄酮組〔(19.17±1.033)g〕大鼠肌張力顯著提高(P<0.05)。

2.3 各組大鼠腓腸肌形態(tài)學(xué)檢測(cè)及肌纖維橫截面積的變化 模型組大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積〔(2 279±468)μm2〕明顯低于正常組〔(2 895±524)μm2〕，與模型組比較，中藥組〔(2 477±451)μm2〕、美雄酮組〔(2 532±510)μm2〕大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積顯著增粗。見圖2。

與正常組比較：1)P<0.01圖1 大鼠體重變化圖

圖2 各組大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積(HE，×400)

2.4 各組大鼠Myhc、MuRF-1蛋白表達(dá)變化 與正常組Myhc、MuRF-1蛋白表達(dá)(0.821 6±0.112 50,0.619 2±0.081 62)比較，模型組大鼠Myhc表達(dá)(0.494 9±0.082 90)顯著下降，MuRF-1(1.053 0±0.148 4)顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組Myhc的表達(dá)(0.725 4±0.070 38)與美雄酮組(0.932 2±0.160 00)顯著增高，MuRF-1表達(dá)顯著下降(0.683 7±0.100 9，0.627 8±0.007 26，P<0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組大鼠組織目的蛋白表達(dá)

3 討 論

骨骼肌衰老是指隨增齡出現(xiàn)的骨骼肌萎縮，體現(xiàn)為肌肉面積指數(shù)〔肌肉面積(kg)/身高(m2)〕降低〔5〕。在70歲以上人群中，骨骼肌萎縮程度與GC濃度的增齡性升高呈正相關(guān)。GC能通過UPS通路加速骨骼肌蛋白的降解進(jìn)程，致使骨骼肌萎縮。UPS是生物體內(nèi)主要的蛋白降解系統(tǒng)，主要包括泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素耦合酶(E2)、泛素蛋白連接酶(E3)、蛋白酶體和去泛素化蛋白〔6〕。MuRF-1是重要的E3家族成員，能夠結(jié)合特異性的靶蛋白序列并誘導(dǎo)靶蛋白發(fā)生泛素化降解〔7〕。本研究采用Noh等〔8〕方法并進(jìn)行改良，建立地塞米松誘導(dǎo)大鼠骨骼肌萎縮模型。與既往研究結(jié)果一致，本結(jié)果表明：地塞米松通過誘導(dǎo)MuRF-1表達(dá)增高，促使Myhc的蛋白降解增高。Myhc是收縮蛋白-肌動(dòng)蛋白的生物活性區(qū)，在肌肉收縮過程中有著重要作用。Myhc過度降解產(chǎn)生的生物學(xué)功能體現(xiàn)為大鼠體重減輕，腓腸肌纖維橫截面積下降，即出現(xiàn)骨骼肌丟失現(xiàn)象，最終導(dǎo)致骨骼肌功能衰退，肌肉最大收縮力減弱。雄性激素如睪酮(T)能部分對(duì)抗GC對(duì)骨骼肌的損傷，促進(jìn)肌肉核酸及蛋白質(zhì)合成代謝，這也是老年人尤其是男性在50歲之后由于T水平增齡性下降而出現(xiàn)骨骼肌衰老的重要原因。合理的外源性T替代療法可有效增強(qiáng)肌肉功能〔9〕。但T依賴劑量、合成代謝效應(yīng)并不清楚，長(zhǎng)期使用易致前列腺癌變等副作用〔10〕，嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用。骨骼肌萎縮以其癥狀表現(xiàn)歸為中醫(yī)“痿證”。痿證由精氣虧虛而起，與脾胃之氣直接關(guān)聯(lián)，但在根本上受到腎中精氣的調(diào)控。腎“先天之氣”與脾“后天之氣”互為關(guān)聯(lián)作用。腎陽不足累及脾陽虧虛，后天之精生成匱乏，進(jìn)而損及腎精，形成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果表明：補(bǔ)腎健脾方并不能有效回升地塞米松注射導(dǎo)致的體重下降，但能有效保護(hù)骨骼肌功能，并增大骨骼肌肌纖維橫截面積，抑制骨骼肌萎縮，提示補(bǔ)腎健脾方能有效對(duì)抗地塞米松對(duì)骨骼肌蛋白的降解作用。服用補(bǔ)腎健脾方能拮抗地塞米松誘導(dǎo)的MuRF-1過度表達(dá)，進(jìn)而阻斷UPS信號(hào)通路，是其抑制骨骼肌蛋白降解、緩解骨骼肌萎縮、改善骨骼肌質(zhì)量的機(jī)制之一。

綜上所述，骨骼肌萎縮受到復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)控制，其機(jī)制除了MuRF通路等〔11〕介導(dǎo)的肌蛋白降解之外，也可能由于肌蛋白合成下降。以往的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎方藥具有雙向、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)〔12〕，值得進(jìn)一步研究。

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〔2016-04-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001565，81473583，81403279)；上海市自然科學(xué)基金(No.16ZR1437400)；上海市博士學(xué)位點(diǎn)建設(shè)科研重點(diǎn)項(xiàng)目(No.B201506)；上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)項(xiàng)目(No.2014YSN04)

龔張斌(1977-)，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥延緩衰老與防治老年病的機(jī)制研究。

金曄華(1991-)，女，碩士，主要從事中醫(yī)藥延緩衰老與防治老年病的機(jī)制研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)01-0013-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.005

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心