王芳芳 曹星華 高旭紅 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

絲膠對2型糖尿病大鼠海馬Bad表達(dá)的影響

王芳芳 曹星華 高旭紅1宋成軍2陳志宏2

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

目的 探討絲膠(彩色蠶繭水提物)對2型糖尿病模型大鼠海馬Bad表達(dá)的影響。方法 取健康雄性SD大鼠，以25 mg/kg的鏈脲佐菌素連續(xù)(1次/d，注射3 d)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，模型成功建立后給予模型大鼠絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，同時(shí)以二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)作為陽性對照藥物。分別采用蛋白印跡法和逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測大鼠海馬Bad蛋白和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 與糖尿病模型大鼠比較，絲膠組大鼠海馬Bad蛋白和mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 絲膠可通過下調(diào)糖尿病模型大鼠海馬Bad的表達(dá)，減弱Bad的促凋亡作用，這可能是絲膠保護(hù)糖尿病海馬損傷的機(jī)制之一。

絲膠；2型糖尿??；Bad；凋亡

研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病(T2DM)模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退〔1〕。學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退的糖尿病模型大鼠，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，因此提示糖尿病海馬損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙可能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)〔2,3〕。前凋亡因子Bad作為凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族——Bcl-2家族成員之一，是蛋白激酶B(PKB/Akt)信號(hào)通路重要的下游組分，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等活動(dòng)，尤其重要的是對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用〔4,5〕。本研究擬探討彩色蠶繭水提物絲膠改善糖尿病大鼠海馬損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性清潔級SD大鼠48只，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，合格證號(hào)：712024。鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma，2%，用檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.4)臨用時(shí)配制；BCA蛋白定量試劑盒、Super ECL Plus超敏發(fā)光液、DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；小鼠抗Bad多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；即用型HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，美國KPL公司；Trizol，美國Invitrogen公司；Bad引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；RT-PCR試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司。絲膠，彩色蠶繭(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供)蒸餾水浸泡24 h后水煎2次，合并濾液后過濾、濃縮，即得。

1.2 分組與給藥 48只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組(BC組)、糖尿病模型組(DM組)、絲膠治療組(ST組)和二甲雙胍陽性對照組(MPC組)，每組12只。采用STZ，(25 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射3 d)腹腔注射法建立T2DM大鼠模型，成模標(biāo)準(zhǔn)是注射STZ 7 d后大鼠的空腹血糖≥16.7 mmol/L。成功建立糖尿病模型后，DM組大鼠不再做任何處理，ST組和MPC組大鼠分別給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃治療35 d。

1.3 標(biāo)本制備 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采取靜脈血，4℃、3 000 r/min離心后去血清，使用全自動(dòng)生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。大鼠取血后斷頭處死，迅速取腦于冰盤上分離雙側(cè)海馬入液氮保存。

1.4 海馬Bad表達(dá)的檢測

1.4.1 蛋白印跡法檢測海馬Bad蛋白的表達(dá) 以BCA蛋白試劑盒定量大鼠海馬的蛋白濃度。取100 μg海馬蛋白質(zhì)上樣，15% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，Bad(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗室溫?fù)u床孵育，super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影，膠片掃描。采用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以Bad條帶灰度/β-actin條帶灰度作為Bad蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測海馬Bad mRNA的表達(dá) 提取海馬總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃、2 min，94℃、30 s，50～65℃、30 s，72℃，1 min，第2步起循環(huán)。引物序列：①Bad，正義:5′-GGCGCTTTGTCGCATCTGTG-3′，反義:5′-TCCTTCTCCTTTGCAGCTTCC-3′；②β-actin，正義:5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義:5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。退火溫度：Bad 60℃、β-actin 29℃，循環(huán)次數(shù)：Bad 31次，β-actin 29次，產(chǎn)物大?。築ad 396 bp、β-actin 445 bp。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物和5 μl DNA Ladder進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用ZF型紫外透射反射分析儀攝像。應(yīng)用Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以Bad條帶光密度/β-actin條帶光密度作為Bad mRNA表達(dá)的相對水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血糖水平檢測結(jié)果 與BC組比較，DM組血糖水平明顯升高(P<0.05)；與DM組大鼠比較，ST組、MPC組血糖水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2 海馬Bad表達(dá)檢測結(jié)果 與BC組比較，DM組海馬Bad的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與DM組比較，ST組、MPC組海馬Bad的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

圖1 蛋白印跡法檢測大鼠海馬Bad蛋白的表達(dá)

圖2 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測大鼠海馬mRNA的表達(dá)

組別血糖(mmol/L)Bad蛋白mRNABC組10.83±2.031)0.3382±0.01391)0.3032±0.01471)DM組29.45±4.820.9485±0.02511.3525±0.0339ST組13.20±4.091)0.5280±0.01751)0.5423±0.01261)MPC組13.18±2.301)0.5269±0.01961)0.6205±0.01021)

與DM組比較：1)P<0.05

3 討 論

細(xì)胞凋亡過程中能保持細(xì)胞膜的完整性，不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔6〕。Bad可與Bcl-2和(或)Bcl-xL結(jié)合形成異源二聚體，減弱Bcl-2和Bcl-xL的抑凋亡作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔7〕。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Bad的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變其在線粒體的位置，在線粒體形成Ca2+內(nèi)流和Cyto C外流的交換通道，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑〔8〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)糖尿病引起海馬損傷與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)而可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。根據(jù)民間蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，結(jié)合《本草綱目》關(guān)于蠶繭的記載：蠶繭，性甘、溫，無毒，具有滋陰潤燥、生精止渴的作用〔9〕，本課題組采用水煎的方法提取蠶繭中的水溶性蛋白——絲膠，前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠能明顯降低DM模型大鼠的血糖并改善DM大鼠肝臟損傷〔10,11〕。本研究結(jié)果顯示，絲膠可通過下調(diào)DM模型大鼠海馬Bad的表達(dá)，減弱Bad的促凋亡作用，這可能是絲膠減少海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)DM海馬損傷的機(jī)制之一。目前，臨床治療DM仍以服用化學(xué)合成的藥物為主(如二甲雙胍等)，各種藥物雖能明顯降低血糖，但不能有效改善胰島素抵抗，長期服用容易產(chǎn)生比較嚴(yán)重的副作用，造成肝、腎損害〔12〕。絲膠約占蠶繭的25%～30%，在提取絲素(用于制作衣料)的過程中被丟棄，不但浪費(fèi)了絲膠也造成了環(huán)境污染。本課題組將深入探討絲膠對DM并發(fā)多臟器損傷的作用，一方面為臨床治療DM及其并發(fā)癥提供新思路，另一方面也有利于蠶桑資源的開發(fā)。

1 郭俊楠，張俊士，賀維亞，等.阿爾茨海默病合并2型糖尿病與海馬損傷——從應(yīng)激反應(yīng)到自噬產(chǎn)生〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2015;48(7):556-63.

2 Wang H,Chen F,Zhong KL,etal.PPARγ agonists regulate bidirectional transport of amyloid-β across the blood-brain barrier and hippocampus plasticity in db/db mice〔J〕.Br J Pharmacol,2016;173(2):372-85.

3 張棟珉，肖 謙，張 穎.血管緊張素Ⅳ對糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及其認(rèn)知功能的影響〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;35(7):978-81.

4 Ghorbani A,Jeddi-Tehrani M,Saidpour A,etal.PI3K/AKT and Mdm2 activation are associated with inhibitory effect of cAMP increasing agents on DNA damage-induced cell death in human pre-B NALM-6 cells〔J〕.Arch Biochem Biophys,2015;566:58-66.

5 Prasad S,Madan E,Nigam N,etal.Induction of apoptosis by lupeol in human epidermoid carcinoma A431 cells through regulation of mitochondrial,Akt/PKB and NFkappaB signaling pathways〔J〕.Cancer Biol Ther,2009;8(17):1632-9.

6 Fiers W,Beyaert R,Declercq W,etal.More than one way to die:apoptosis,necrosis and reactive oxygen damage〔J〕.Oncogene,1999;18(54):7719-30.

7 Yao Y,Dou C,Lu Z,etal.MACC1 suppresses cell apoptosis in hepatocellular carcinoma by targeting the HGF/c-MET/AKT pathway〔J〕.Cell Physiol Biochem,2015;35(3):983-96.

8 何家璇.Bad蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2007;13(3):161-3.

9 李時(shí)珍.本草綱目〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：1045-52.

10 付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(1):103-5.

11 侯麗娜，陳 程，劉東慧，等.絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟肝細(xì)胞核因子-4α表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(4):20140-2.

12 Gambaro V,Dell′acqua L,Farè F,etal.A case of fatal intoxication from metformin〔J〕.J Forensic Sci,2007;52(4):988-91.

〔2016-02-15修回〕

(編輯 郭 菁)

Effects of sericin on Bad expression in hippocampus of type 2 diabetic rats

WANG Fang-Fang, CAO Xing-Hua, GAO Xu-Hong,et al.

Department of Neurology, Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei, China

Objective To investigate the effects of sericin (water extracts of color silkworm cocoon) on Bad expression in hippocampus of type 2 diabetic rats.Methods Healthy male SD rats were used to establish type 2 diabetes rats model by intraperitoneally injecting streptozotocin (25 mg/kg, 1 time a day, 3 days). Then the model rats were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) for 35 days. The metformin (55.33 mg·kg-1·d-1) was used as positive control drug at the same time. Western blot and RT-PCR were used to detect the expressions of Bad protein and mRNA in hippocampus.Results Compared with those of type 2 diabetes model rats, the expressions of Bad protein and mRNA in hippocampus of rats using sericin were declined obviously (P<0.05).Conclusions Sericin could weaken the role of Bad in promoting apoptosis by down-regulation the Bad expression in hippocampus; this maybe one of the mechanisms that sericin protecting hippocampus injury during diabetes.

Sericin;Type 2 diabetes mellitus;Bad;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81441133)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2012406018)；河北省高校重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究。 宋成軍(1972-)，男，碩士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究。

王芳芳(1964-)，女，主要從事神經(jīng)內(nèi)科方面的研究。

R587

A

1005-9202(2017)01-0007-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.003

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 2 承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室