樊開(kāi)陽(yáng) 朱麗娜 張文利 張海瑞 張 瑜 馬 莉

(大連醫(yī)科大學(xué)流行病學(xué)教研室,遼寧 大連 116044)

MPTP誘導(dǎo)小鼠帕金森病亞急性模型和慢性模型的比較

樊開(kāi)陽(yáng) 朱麗娜 張文利1張海瑞2張 瑜 馬 莉

(大連醫(yī)科大學(xué)流行病學(xué)教研室,遼寧 大連 116044)

目的 探討對(duì)比1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的帕金森病(PD)小鼠亞急性模型和慢性模型的行為學(xué)及組織病理學(xué)變化。方法 亞急性模型C57/BL小鼠腹腔注射MPTP 25 mg/kg，每天1次，連續(xù)注射7 d；慢性模型C57/BL小鼠腹腔注射MPTP 25 mg/kg，每周注射2次，連續(xù)注射5 w。通過(guò)爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的行為學(xué)變化；應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)的含量；應(yīng)用免疫組化染色法檢測(cè)中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，慢性組小鼠行為學(xué)改變明顯，而亞急性組小鼠無(wú)明顯改變。在爬桿實(shí)驗(yàn)中，慢性組小鼠爬桿所用的時(shí)間長(zhǎng)于亞急性組；懸掛實(shí)驗(yàn)中，慢性組小鼠懸掛時(shí)間低于亞急性組。兩組小鼠紋狀體DA含量明顯降低(P<0.05)，但慢性組與亞急性組相比DA含量降低程度更明顯(P<0.05)；而5-HT含量未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)；中腦黑質(zhì)致密部TH陽(yáng)性細(xì)胞減少方面，亞急性組下降至對(duì)照組28%，慢性組下降至對(duì)照組的17%；慢性組HE染色切片中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡最多，而亞急性組神經(jīng)細(xì)胞相對(duì)凋亡較少。結(jié)論 MPTP的PD小鼠慢性模型與亞急性模型相比，具有更明顯的與人類PD相似的臨床癥狀，是以后進(jìn)一步研究PD病理生理學(xué)機(jī)制的潛在穩(wěn)定模型。

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)；帕金森病

帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)于中老年的神經(jīng)退行性進(jìn)展性疾病，主要表現(xiàn)為震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)步態(tài)異常，主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)紋狀體多巴胺(DA)能神經(jīng)元的選擇性缺失以及胞質(zhì)內(nèi)涵物L(fēng)ewy小體的形成。為了更深入地研究PD的病因?qū)W、病理、代謝生化及治療等，制作最接近PD病人臨床癥狀的長(zhǎng)期PD動(dòng)物模型至關(guān)重要。PD在動(dòng)物中沒(méi)有自發(fā)的傾向，進(jìn)行PD病理機(jī)制研究必須建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型。目前人們已創(chuàng)造和建立了多種PD動(dòng)物模型，主要是神經(jīng)毒劑損傷模型和轉(zhuǎn)基因模型，前者包括1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)靈長(zhǎng)類及小鼠模型，6-羥基DA大鼠模型以及利血平、魚(yú)藤酮、百草枯等模型；后者主要是小鼠及果蠅轉(zhuǎn)基因模型等〔1〕。其中MPTP致PD小鼠模型由于作用明確，是目前最常用的PD動(dòng)物模型之一〔2〕，它能較全面地反映PD病因及發(fā)病機(jī)制、病理特點(diǎn)。MPTP小鼠模型應(yīng)用較多的是急性或亞急性PD模型，但該模型損傷易在較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)。而人類PD是一個(gè)長(zhǎng)期的進(jìn)行性發(fā)展性疾病，需要一個(gè)能產(chǎn)生損傷保持時(shí)間長(zhǎng)從而達(dá)到接近臨床PD病理變化的穩(wěn)定模型。而研究表明MPTP誘導(dǎo)的小鼠慢性PD動(dòng)物模型就具備這一優(yōu)勢(shì)〔3〕。本次研究通過(guò)比較亞急性和慢性PD模型，動(dòng)物的行為學(xué)和組織病理學(xué)變化的不同，驗(yàn)證慢性模型在探討PD發(fā)病機(jī)制方面的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料 MPTP，DA，5-羥色胺(5-HT)均購(gòu)于Sigma公司；小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體：購(gòu)于Abcam公司；SP法免疫組化試劑盒：購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。高效液相色譜儀,美國(guó)Waters，型號(hào) 1525；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus，型號(hào)CKX41。SPF級(jí)雄性C57/BL小鼠，8～10周齡，體重20～25 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制作 C57/BL雄性小鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表分為亞急性組、對(duì)照組、慢性組，每組10只。MPTP用生理鹽水溶解，配制成2.5 mg/ml溶液，小鼠腹腔注射，具體方法見(jiàn)表1。

表1 MPTP致小鼠模型建立

組別藥物給藥量給藥時(shí)間間隔給藥次數(shù)對(duì)照組生理鹽水10ml/kg3.5d/次10亞急性組MPTP25mg/kg(10ml/kg)1d/次6慢性組MPTP25mg/kg(10ml/kg)3.5d/次10

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè) 每次注射完之后，觀察小鼠活動(dòng)情況有無(wú)異常。最后一次注射后1、3 d分別進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試(爬桿和懸掛)，在每次正式實(shí)驗(yàn)之前，每只小鼠需進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 爬桿測(cè)試 制作一個(gè)直徑1 cm，長(zhǎng)50 cm并且頂端固定有一個(gè)直徑為1.5 cm小球的桿，并且纏上紗布以增加摩擦，將桿豎直放置。將小鼠頭放置在小球上，記錄小鼠從開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時(shí)間和爬桿底部的時(shí)間。每只小鼠進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)，取均值。

1.2.2.2 懸掛測(cè)試 將小鼠前爪懸掛于距地面30 cm水平放置的金屬絲上，記錄從開(kāi)始懸掛至落地時(shí)的時(shí)間；

1.2.3 取材 最后一次注射后第7天，動(dòng)物處死解剖取組織：(1)每組隨機(jī)抽取4只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定，取整個(gè)腦組織并放入4%多聚甲醛中4℃保存；(2)每組剩余的6只小鼠摘除眼球取血后處死，解剖，取紋狀體并用錫箔紙包好后-80℃保存。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取出浸泡在4%多聚甲醛中4℃保存的腦組織，石蠟包埋，中腦黑質(zhì)部冠狀切片，制作石蠟切片，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及TH免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5 高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè) 色譜柱：C18柱(3.9 mm×150 mm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(0.03%三氟乙酸)=3∶97，pH3.7；流速1 ml/min；熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)315 nm；柱溫35℃，進(jìn)樣量：20 μl；流動(dòng)相的配制：色譜純甲醇為A液，取300 μl純的三氟乙酸用超純水定容到1 000 ml得0.03%三氟乙酸溶液(B液)，A∶B=3∶97。配制DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別是200 ng/ml和160 ng/ml。取出-80℃保存的小鼠紋狀體并進(jìn)行蛋白提取。

1.3 圖像和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0軟件行因素方差分析；免疫組化圖片運(yùn)用IPP軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為學(xué)變化 慢性組小鼠在第4次給藥后，每次注射完畢3 min內(nèi)出現(xiàn)肢體僵直、豎尾、豎毛、呼吸急促，隨后出現(xiàn)平衡障礙，身體劇烈震顫，暴躁等現(xiàn)象，20 min后恢復(fù)，但活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)低下，12 h后恢復(fù)正常狀態(tài)。亞急性組和對(duì)照組無(wú)明顯異常變化。

2.1.1 爬桿 與對(duì)照組相比，亞急性組小鼠的爬桿時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而慢性組小鼠的爬桿時(shí)間差異顯著(P<0.05)，慢性組小鼠爬桿時(shí)間明顯大于亞急性組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.1.2 懸掛 與對(duì)照組相比，亞急性組小鼠的懸掛時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而慢性組小鼠的懸掛時(shí)間差異顯著(P<0.05)，且慢性組小鼠懸掛時(shí)間明顯低于亞急性組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 紋狀體中DA和5-HT的含量 與對(duì)照組相比，慢性組和亞急性組小鼠紋狀體中DA的含量明顯降低(P<0.05)；而慢性組與亞急性組相比，DA含量明顯降低(P<0.05)；三組小鼠紋狀體中的5-HT含量有一定變化，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組別爬桿時(shí)間1d3d懸掛時(shí)間1d3d對(duì)照組8.31±2.588.06±3.6186.38±39.4091.77±62.44亞急性組8.11±2.459.26±2.7299.00±50.77102.83±29.16慢性組11.56±3.201)2)14.44±6.011)2)47.69±23.381)2)43.31±18.591)2)

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與亞急性組比較：2)P<0.05；下表同

組別DA5-HT對(duì)照組1237.16±4.5056.45±46.47亞急性組154.76±28.501)53.82±6.92慢性組37.82±20.261)2)56.04±71.72

2.3 HE染色 見(jiàn)圖1。對(duì)照組中腦黑質(zhì)部神經(jīng)細(xì)胞聚集，輪廓清晰，核深染且胞質(zhì)界限清晰。與對(duì)照組相比，亞急性組中腦黑質(zhì)部切片變化不明顯，神經(jīng)細(xì)胞較密集，較少部分的細(xì)胞形態(tài)改變，核仁染色較淺，部分細(xì)胞核消失，胞質(zhì)較渾濁；而慢性組中腦黑質(zhì)切片變化較大，部分神經(jīng)細(xì)胞減少，形態(tài)改變的細(xì)胞較多，核仁染色較淺甚至消失，與胞質(zhì)的界限不明顯。

圖1 3組HE染色結(jié)果(×400)

2.4 黑質(zhì)部TH免疫組化染色 三組小鼠的中腦黑質(zhì)部冠狀切片，經(jīng)TH免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，慢性組和亞急性組的TH陽(yáng)性細(xì)胞染色顯著減弱，亞急性組下降至對(duì)照組的28%，慢性組下降至對(duì)照組的17%。如圖2。

圖2 黑質(zhì)部TH免疫組化染色結(jié)果(DAB，×100)

3 討 論

在本次實(shí)驗(yàn)中，慢性組小鼠在實(shí)驗(yàn)后期給藥后會(huì)出現(xiàn)僵直、豎尾、豎毛、呼吸急促，平衡障礙，身體劇烈震顫，暴躁，活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)低下等現(xiàn)象，雖然持續(xù)時(shí)間較短，但與PD行為學(xué)上的臨床表現(xiàn)更為相似。同時(shí)，采用爬桿和懸掛實(shí)驗(yàn)作為測(cè)定小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力的指標(biāo)，慢性組比亞急性組小鼠的爬桿所需時(shí)間更長(zhǎng)，懸掛支撐時(shí)間較短，更能表現(xiàn)出PD在行為學(xué)上的改變。

PD病理變化核心是黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的丟失，而MPTP可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦中，進(jìn)而生成1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)，MPP+高度親和DA載體，因此被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入DA能神經(jīng)元，選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元〔4〕，從而產(chǎn)生類似DA的病理改變〔5〕。MPTP對(duì)DA能神經(jīng)元的毒作用主要包括以下幾個(gè)方面：可以導(dǎo)致一氧化氮(NO)大量生成，導(dǎo)致自由基的過(guò)度產(chǎn)生，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，抑制線粒體呼吸鏈，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔6〕。這幾個(gè)方面均可造成黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的凋亡。而本文主要研究運(yùn)用MPTP制作亞急性和慢性PD小鼠模型的區(qū)別，首先，與對(duì)照組相比，亞急性和慢性兩種模型都具有一定的可行性。TH是負(fù)責(zé)催化氨基酸L-酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎u基苯丙氨酸(多巴)的酶，而多巴是DA的前提，在DA生物合成中起重要的調(diào)節(jié)作用。TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目可反映紋狀體DA含量及DA能神經(jīng)元的數(shù)量〔7〕。在本研究中，三組小鼠相互之間的中腦黑質(zhì)部冠狀切片的TH免疫組化染色具有較明顯的差異，且慢性組與亞急性組相比減弱程度更明顯，從而說(shuō)明相對(duì)于MPTP亞急性模型，MPTP慢性模型更能表現(xiàn)PD病理上的變化。而通過(guò)觀察小鼠中腦黑質(zhì)部冠狀HE染色切片，發(fā)現(xiàn)慢性組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡最多，亞急性神經(jīng)細(xì)胞相對(duì)凋亡較少，從而說(shuō)明，在形態(tài)學(xué)上，慢性模型更符合PD DA神經(jīng)元凋亡的特征。

5-HT作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于松果體和下丘腦，可能參與痛覺(jué)、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中，三組小鼠紋狀體中的5-HT的含量有一定變化，但差異不顯著。造成這種情況的原因可能是MPTP高選擇性的對(duì)DA能造成損傷〔4,8,9〕，但對(duì)5-HT神經(jīng)元可能不具有特異損傷或者特異性損傷較輕。

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〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Comparison of subacute and chronic Parkinson disease model in mice model induced by MPTP

FAN Kai-Yang, ZHU Li-Na, ZHANG Wen-Li,et al.

Department of Epidemiology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning, China

Objective To compare behavioral and histopathological changes of subacute and chronic Parkinson disease(PD) mice model induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy ridine(MPTP).Methods Subacute C57/BL mice model was intraperitoneally injected(ip) MPTP 25 mg/kg 1 time per day for 7 days; chronic C57/BL mice model were intraperitoneally injected(ip) MPTP 25 mg/kg 2 times per week for 5 weeks.The behavioral changes of mice was inspected by climbing pole and suspension test; the content of DA in stratium was detected by HPLC; and the tyrosine hydroxylase (TH) expression in substantia nigra was detected by immunohistochemical staining.Results Compared with that of control group，the behavior of chronic model group was changed significantly. The suspension capability of chronic model group was weaker than that of subacute model group in suspension experiment. The content of DA in stratium of chronic and subacute model groups was decreased significantly, and in chronic group, it was significant lower than that of subacute model group (P<0.05). The amount of TH positive cells was reduced in the midbrain substantia nigra compacta. Nerve cell apoptosis was most in chronic group and relatively less in subacute group.Conclusions The chronic PD mice model induced by MPTP has more obvious and similar clinical symptoms and is the potential stability model for further investigating PD pathology physiology mechanism.

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy ridine(MPTP); Parkinson′s disease

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200989)

馬 莉(1972-)，女，教授，主要從事慢性病流行病學(xué)研究。

樊開(kāi)陽(yáng)(1990-)，男，碩士，主要從事帕金森病生物標(biāo)志物的研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)01-0004-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.002

1 大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室 2 西安醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生管理學(xué)教研室