林燕俞忠明陳宇

1浙江省杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院浙江杭州311200

2浙江省中醫(yī)藥研究院浙江杭州310007

桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響研究*

林燕1俞忠明2陳宇2

1浙江省杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院浙江杭州311200

2浙江省中醫(yī)藥研究院浙江杭州310007

目的：研究桑黃對S180荷瘤小鼠的免疫功能作用。方法：采用對小鼠S180實體瘤的抑制作用、ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、血清溶血素檢測以及正常小鼠碳廓清試驗。結(jié)果：桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠抑瘤率優(yōu)于陽性對照組人參組，但與模型組比無顯著性差異；桑黃水煎液高、低劑量組對S180荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用優(yōu)于陽性對照組人參組，但差異無統(tǒng)計學意義，且與模型組比無顯著性差異；桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠T淋轉(zhuǎn)、溶血素水平無明顯影響；桑黃水煎液對正常小鼠碳廓清水平無明顯影響。結(jié)論：桑黃水煎液的腫瘤免疫作用不明顯，要深入研究其腫瘤免疫作用需進一步進行成分分離、純化，進行不同部位的系統(tǒng)藥效作用研究，以便客觀評價其功效。

桑黃 S180荷瘤 小鼠 免疫功能 實驗研究

桑黃是一種珍貴的多年生大型藥用真菌，由于大多生長在桑屬植物上且子實體為黃褐色而得名，始載于《本草綱目》?！端幮哉摗酚涊d桑黃味微苦、性寒，臨床多用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹?jié)?、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)等癥[1]。桑黃的現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝等功效。本文通過桑黃水煎夜對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響研究，來進一步評價其藥理作用。

1 材料

1.1 動物：ICR種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號碼：SCXK（滬）2008-0016，動物合格證號：2008001619934、2008001620192、2008001620612；動物均飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，許可證號：SYXK(浙2009-0122)。

1.2 藥物及試劑：桑黃水煎液（1.0g生藥/ml，200ml/瓶）、人參提取液（0.8g生藥/ml，25ml/瓶），均由中藥研究中心提供；吲哚美辛腸溶片（25mg/片×100片，批號A110103），山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn)；二甲苯、冰醋酸（均為分析純），杭州化學試劑廠生產(chǎn)。

1.3 儀器：GS-6R離心機（Beckman公司）；HR40-Ⅱ-A2醫(yī)用凈化工作臺（A2型，30%外排，70%循環(huán)），青島海爾特種電器有限公司；BS210S電子天平（Sartorius公司）；YXQ-208SD電熱蒸汽滅菌器（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）；UV1000紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；Yamato RE600旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本yamato）；FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；YJ-40L/h型超純水機（杭州余杭亞潔水處理設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備：分述如下。

2.1.1 桑黃水煎液制備：桑黃粉碎，稱取200g，加8倍量水，浸泡30min，煎煮1h，濾過，濾渣加6倍量水，煎煮0.5h，濾過，濾渣加5倍量水，煎煮0.5h，濾過，合并濾液，濃縮至生藥含量1g/ml的桑黃水煎液，4～8℃冷藏保存，供體內(nèi)抗炎及腫瘤免疫作用試驗。

2.1.2 人參水煎液的制備：別直參（購自浙江省立同德醫(yī)院中藥房），粉碎，加10倍量水，浸泡30min，煎煮提取1h，濾過，濾渣加8倍量水，煎煮提取0.5h，濾過，濾渣加6倍量水，煎煮提取0.5h，濾過，合并濾液，水浴濃縮至生藥含量為0.8g/ml的人參水煎液，4～8℃冷藏保存，作為免疫試驗的陽性對照用藥。

2.2 桑黃水煎液對荷瘤小鼠免疫功能的影響：分述如下。

2.2.1 對小鼠S180實體瘤的抑制作用：ICR小鼠50只，全為雌性，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，均皮下注射S180細胞懸液（1×107個/ml）0.2ml/只，次日隨機分組，分為5組，每組10只，稱體重。實驗設(shè)高劑量組（桑黃水煎液18.0g生藥/kg）、中劑量組（6.0g生藥/kg）、低劑量組（2.0g生藥/kg）；并設(shè)人參對照組（2.0g/kg）及模型對照（蒸餾水25ml/kg）。各組連續(xù)灌胃給藥17天，停藥次日，稱體重，處死小鼠、剝離實體瘤、稱瘤重，計算抑瘤率（%），結(jié)果見表1。桑黃水煎液對小鼠S180實體瘤的抑瘤率為4.71%～23.83%，與模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 桑黃水煎液對S實體瘤的抑制作用（±s）180

表1 桑黃水煎液對S實體瘤的抑制作用（±s）180

體重（g）組別瘤重(g)抑制率(%) 4.71 16.52 23.83 13.21—高劑量組中劑量組低劑量組人參組模型組實驗前25.80±1.57 25.90±1.59 25.90±1.56 25.80±1.31 25.90±1.32實驗后36.60±2.77 36.00±3.35 34.80±3.97 36.20±2.19 37.20±3.97 8.64±2.85 7.57±3.73 6.91±3.34 7.87±2.11 9.07±2.54

2.2.2 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：分組及給藥同2.2.1，實驗同時設(shè)正常小鼠組，正常組小鼠10只，除正常組與模型對照組，各組連續(xù)灌胃給藥17天，停藥次日，稱體重，脫頸椎法處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕撕碎，制成單細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，洗滌，計數(shù)，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×1O7個/ml。采用刀豆蛋白（ConA）誘導的3H-TdR摻入法測定T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能，結(jié)果見表2。S180模型小鼠T淋轉(zhuǎn)水平有明顯降低，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠T淋轉(zhuǎn)水平無明顯影響，與模型對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.3 血清溶血素檢測(HC50檢測法)：實驗分組及給藥同2.2.1，給藥13天后，取5%（v/v）的羊血，每只小鼠腹腔注射0.2ml進行免疫。4天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，分離血清。用SA緩沖液稀釋血清（荷瘤動物組血清150倍稀釋，正常對照組血清700倍稀釋）。將稀釋后血清1ml置試管內(nèi)，依次加入10%（v/v）綿羊紅細胞（SRBC）0.5ml，補體（用SA 1：7稀釋）1ml。另設(shè)不加血清的對照管。37℃水浴中保溫20min，冰浴終止反應(yīng)。離心，取上清液1ml，加都氏液3ml，同時另取10%（v/v）SRBC 0.25ml，加都氏液4ml，充分混勻，放置10min后，于分光光度計540nm波長處以對照管作空白，分別測定各管OD值。計算半數(shù)溶血值（HC50），結(jié)果見表2。S180模型小鼠溶血素水平有明顯降低，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠溶血素水平無明顯影響，與模型對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.4 小鼠碳廓清試驗：實驗分組及給藥同2.2.1，各組連續(xù)灌胃給藥17天，停藥次日，每鼠尾靜脈注入用生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，0.1ml/10g體重，待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2、10分鐘分別從內(nèi)眥靜脈叢取血2Oμl，并將其加到2ml 0.1%Na2CO3溶液中，分光光度計于60Onm波長處測光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白對照。第二次采血結(jié)束后，立即處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。計算吞噬指數(shù)，結(jié)果見表3。桑黃水煎液對正常小鼠碳廓清水平無明顯影響，與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠免疫功能影響（s）

表2 桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠免疫功能影響（s）

注：與正常對照組比較*P＜O.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜O.05。

HC50值27.7±23.6 35.5±34.1 37.5±34.1 79.4±46.0△37.5±32.1**212.9±88.9組別高劑量組中劑量組低劑量組人參組模型對照組正常對照組T淋轉(zhuǎn)（cpm）8655.3±4224.7 5407.2±2510.4 6914.4±2315.5 6804.0±6245.6 5927.0±1909.1*13369.0±5591.4

表3 桑黃水煎液對小鼠碳廓清試驗的影響（±s）

表3 桑黃水煎液對小鼠碳廓清試驗的影響（±s）

組別吞噬指數(shù)4.279±0.414 4.245±0.830 4.220±0.486 4.645±0.678 4.192±0.634高劑量組中劑量組低劑量組人參組正常對照組體重（g）實驗前24.5±1.84 25.0±1.12 24.7±1.77 24.8±1.28 25.0±1.13實驗后28.9±3.12 29.7±2.29 29.4±2.85 29.6±2.47 29.8±2.95

3 討論

桑黃中主要含有黃酮、三萜、多酚，以及多糖類成分，能夠起到抗腫瘤、抗炎、降血脂等作用。免疫試驗結(jié)果顯示：桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠抑瘤率優(yōu)于陽性對照組人參組，但與模型組比無顯著性差異；桑黃水煎液高、低劑量組對S180荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用優(yōu)于陽性對照組人參組，但差異無統(tǒng)計學意義，且與模型組比無顯著性差異；桑黃水煎液對S180荷瘤小鼠T淋轉(zhuǎn)、溶血素水平無明顯影響；桑黃水煎液對正常小鼠碳廓清水平無明顯影響。如需深入研究桑黃的免疫作用，需進一步進行成分分離、純化，進行不同部位的系統(tǒng)藥效作用研究，才能得到更客觀的評價。

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1995：1967.

2016-09-29

浙江省科技計劃項目桑黃抗腫瘤活性研究及在規(guī)?；斯ぴ耘嘀械膽?yīng)用，編號：2012C33125