趙清，王婧，王來(lái)芳

（河南大學(xué)淮河醫(yī)院，風(fēng)濕免疫科，河南開(kāi)封475000）

臨床論著

IL-7R在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義

趙清，王婧，王來(lái)芳

（河南大學(xué)淮河醫(yī)院，風(fēng)濕免疫科，河南開(kāi)封475000）

目的探討白細(xì)胞介素7受體（IL-7R）基因在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（KOA）疾病中的表達(dá)作用及意義，為其診斷和治療以及進(jìn)一步研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。方法選取河南大學(xué)淮河醫(yī)院骨科70例患者新鮮滑膜組織，采用Trizol法提取總RNA，采取Applied Biosystems逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time RT-PCR）檢測(cè)膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜組織中IL-7R基因的表達(dá)。結(jié)果IL-7R基因表達(dá)在KOA滑膜組織中降低（P＜0.05）。結(jié)論IL-7R在KOA滑膜中的表達(dá)下降，且與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎病變有密切的關(guān)聯(lián)，為檢測(cè)和治療KOA疾病提供一定數(shù)據(jù)支撐和參考。

骨關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素7受體；基因；滑膜組織

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種漸進(jìn)性喪失功能的骨科常見(jiàn)退行性疾病[1]。它是一種嚴(yán)重危害中老年人健康的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬、失去活動(dòng)靈活性或致殘[2]。在臨床上最為常見(jiàn)的是膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），且其發(fā)病率很高，是一組有著不同病因卻有著相似的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)的疾病[3]。目前，對(duì)于KOA的治療方法主要是早期采用藥物治療來(lái)保護(hù)患者和延緩病變，或利用玻璃酸鈉聯(lián)合復(fù)方倍他米松注射于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，對(duì)KOA有顯著療效且無(wú)明顯的不良反應(yīng)[4]。而對(duì)于嚴(yán)重的晚期患者，就要采用手術(shù)治療方法，研究表明，KOA發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程與多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子有關(guān)，如白細(xì)胞介素1家族、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子和炎癥因子等[5]。其中炎癥因子大部分為炎性滑膜組織分泌，白細(xì)胞介素7受體（interleukin-7 receptor，IL-7R）就是該過(guò)程中最重要的炎癥因子之一。在淋巴細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中IL-7R是必不可缺少的因子，而導(dǎo)致B系淋巴細(xì)胞和T系淋巴細(xì)胞生成的障礙主要是其在細(xì)胞表面的缺失[6]，造成重癥聯(lián)合免疫缺陷病主要是IL-7Rα或c缺陷引起的T細(xì)胞缺乏。最新研究表明，阻斷IL-7R可以治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄集合酶鏈反應(yīng)（real time RT-PCR）方法檢測(cè)IL-7R基因在KOA滑膜中的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

OA組：取膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)患者40例，平均年齡為（65.66±1.34）歲的膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜組織。對(duì)照組：取在關(guān)節(jié)鏡下交叉韌帶損傷和半月板損傷患者30例，平均年齡為（21.78± 2.58）歲的膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜組織。

取下的膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜組織離體后，直接置于含有液氮的無(wú)菌管中，30 min后放入-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

KOA患者均符合放射線Kellgren-Lawrence分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)的Ⅲ、Ⅳ級(jí)（見(jiàn)表1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol Reagent（Invitrogen公司），M-MLV Reverse Transcriptase（Invitrogen公司），SuperscriptⅢRT（Invitrogen公司），RNase out（Invitrogen公司），Primers：9N Random Primer及PCR Primers（Invitrogen公司），5×First-Strand Buffer（Pro Mab公司），2×Loading Buffer（Pro Mab公司），Recombinant Rnasin R RNase Inhibitor（Promega公司），dNTP Mixture（TaKaRa公司），2 000 bp DNA maker（TaKaRa公司），Ex Taq酶（Fermentas公司），0.1 mol DTT（碧云天生物技術(shù)研究所），Power SYBR R Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司）。

表1 Kellgren-Lawrence分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

Real time RT-PCR儀7500型（Applied Biosystems公司），電泳儀及電源、附件（BIO-RAD公司），全自動(dòng)菌落及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司），低溫度高速離心機(jī)（SIGMA公司），超低溫冰箱（-80℃）（Forma Scientific公司），低溫冰箱（-20℃）（海爾電器有限公司），各種無(wú)酶吸頭（Axygen公司），各種無(wú)酶EP管（Axygen公司），Tube管（Axygen公司），研磨器（Roche公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 RNA的提?。═rizol法）取約100 mg新鮮冷凍膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜組織，將其研成粉末，充分揮發(fā)液氮，加入1 ml Trizol Reagent，混勻，室溫下靜置10 min。再加入200 μl氯仿，劇烈震蕩混勻，靜置8 min，分層。在4℃的條件下離心15min（15000r/min）。吸取上層水液400 ml，移至1.5 ml Tube管中。再加入等體積異丙醇溶液，混勻，室溫下靜置8 min。再在4℃的條件下離心15 min（15 000 r/min）。棄去上清液，加入經(jīng)DEPC處理的75％冷乙醇，斡旋震蕩，使沉淀漂浮，4℃離心5 min（15 000 r/min），再棄去上清液，干燥。在20μl的Tube管中用ddH2O溶解RNA。取2μl RNA，用ddH2O稀釋100倍，即得。

1.5.2 cDNA第一鏈的合成取2μg RNA置于反應(yīng)管中，加入Oligo dT 1μl，再加入2.5 mmol dNTP mix 4μl，混勻，加ddH2O至13μl。在60℃條件下靜置10 min后，放在冰上放置1min以上。再在反應(yīng)管中加入5×First-Strand Buffer 4μl，0.1 mmol DDT 1μl，RNase out（40 u/μl）1μl，SuperscriptⅢRT 1μl，震蕩混勻后離心，在70℃條件下通過(guò)滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA第一鏈，在4℃條件下保存。

1.5.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見(jiàn)表2。逆轉(zhuǎn)錄終止反應(yīng)程序：在70℃條件下加入1.5 mol NaOH 5μl終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，10 min后，加入10mol/L乙酸1μl中和，再加入Nuclease-Free Water至50μl，在4℃可以短期低溫保存，置入-80℃冰箱長(zhǎng)期低溫保存。

1.5.4 逆轉(zhuǎn)錄終止反應(yīng)程序在70℃條件下加入1.5 mol氫氧化鈉5μl終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，10 min后，加入10 mol/L乙酸1μl中和，再加入Nuclease-Free Water至50μl，在4℃可以短期低溫保存，置入-80℃冰箱長(zhǎng)期低溫保存。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3。實(shí)時(shí)定量PCR程序見(jiàn)表4。

1.5.5 實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物1.5％非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)表5。1.5％非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條件：120 V，15～20 min。1.5％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條件：120～130 V，15～20 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本實(shí)驗(yàn)按照隨機(jī)、對(duì)照、均衡及重復(fù)的分組設(shè)計(jì)原則，對(duì)其行多組間t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

表3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系

表4 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序

表5 實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物1.5％非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2 結(jié)果

2.1 組織總RNA電泳鑒定

1.5 ％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中可以看出，real time RT-PCR反應(yīng)的特異性都非常好。見(jiàn)圖1。

2.2 Real time RT-PCR分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KOA患者膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜組織較正常滑膜組織中IL-7R基因表達(dá)降低。見(jiàn)圖2。

2.3 IL-7R mRNA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

IL-7R mRNA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見(jiàn)表6。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中IL-7R的表達(dá)量低于正常膝關(guān)節(jié)滑膜組織的表達(dá)。

圖1 電泳結(jié)果

圖2 骨關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)滑膜組織與正常滑膜組織對(duì)IL-7R mRNA的表達(dá)

表6 人膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織與正?；そM織對(duì)IL-7R mRNA的相對(duì)表達(dá)量（±s）

項(xiàng)目P值2-△△Ct0.15±0.640.90±0.120.001骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織正?；そM織

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于運(yùn)用白細(xì)胞介素7受體診斷和治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的研究并不多，故本文研究IL-7R基因與KOA患者的關(guān)系。通過(guò)RT-PCR的方法對(duì)KOA患者和正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-7R基因在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達(dá)明顯降低。

骨關(guān)節(jié)炎是一種與年齡有密切關(guān)系的骨科普遍疾病，隨著世界老齡化人口的增多，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者的發(fā)病率也有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，嚴(yán)重地影響老年人的正常生活以及生活質(zhì)量。骨關(guān)節(jié)炎最終病理變化的主要特征是關(guān)節(jié)軟骨的變性和破壞，主要是由于軟骨合成與降解平衡的失調(diào)所造成的[9-10]。而骨關(guān)節(jié)炎的主要特征是軟骨下骨的硬化和骨贅的形成[11]。在該過(guò)程中是滑膜炎癥的影響和參與導(dǎo)致軟骨的結(jié)構(gòu)變化。現(xiàn)今治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎還未有比較合適的方法，而目前的基因治療骨關(guān)節(jié)炎正在逐漸成為研究的熱點(diǎn)[12]。近幾年研究表明，細(xì)胞因子與KOA的形成及發(fā)展有著十分密切的關(guān)系，其中的白細(xì)胞介素與白細(xì)胞介素受體就起著至關(guān)重要的作用[13]。

白細(xì)胞介素7受體是由一條特異性配體結(jié)合α鏈（IL-7Rα）與一條公用鏈（c）結(jié)合而成的[14]。研究表明，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中的IL-7R α，比KOA患者表達(dá)更高，其表達(dá)且與白細(xì)胞介素7的表達(dá)有著密不可分的關(guān)系[15-16]。白細(xì)胞介素7受體信號(hào)途徑可以影響軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素7，且也可以表達(dá)白細(xì)胞介素7受體，并能夠接受白細(xì)胞介素7傳播的刺激信號(hào)，且可以分泌能夠降解軟骨中蛋白聚糖的基質(zhì)金屬蛋白酶13和蛋白多糖，故可以通過(guò)阻斷白細(xì)胞介素7受體的方法，來(lái)防止軟骨的降解及骨質(zhì)的損壞[17]。

本研究結(jié)果表明，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織比正常的滑膜組織有明顯的基因表達(dá)差異。在KOA患者的膝關(guān)節(jié)滑膜中形成的IL-7R在KOA的病理過(guò)程中起到重要的作用，而其也有可能是造成膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥持續(xù)化及慢性化的主要原因。在今后的診斷和治療中可以把IL-7R作為一個(gè)靶點(diǎn)，為臨床上治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎提供一個(gè)新的方法。

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（張西倩 編輯）

Expression and significance ofIL-7Rgene in synovium of osteoarthritic knee

Qing Zhao,Jing Wang,Lai-fang Wang
(Department of Immunology,Huaihe Hospital of Henan University,Kaifeng, Henan 475000,China)

ObjectiveTo discuss expression of knee joint synovialIL-7Rgenes in knee osteoarthritis(KOA)and the significance so as to provide scientific basis for diagnosis,treatment and research of knee osteoarthritis.MethodsFresh synovial tissue was collected from 70 orthopedic patients in a hospital.Trizol method was used to extract total RNA in the synovial tissue.The Applied Biosystems retrovirus kit was used to synthesize the first chain of cDNA through reverse transcription.The expression ofIL-7Rgene in osteoarthritic knee synovium was detected by RT-PCR.ResultsIL-7Rgene expression in osteoarthritic knee synovial tissue obviously decreased(P＜0.01).ConclusionsIL-7Rexpression in the osteoarthritic knee synovial tissue obviously decreases and is positively correlated with the progression of KOA.Therefore,it provides available information for the detection and treatment of KOA.

osteoarthritis;IL-7R;gene;synovial tissue

R684.3

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.009

1005-8982（2017）02-0052-04

2016-07-09