溫存 杜俊英 房軍帆 樂小琴 付桃芳 肖婷 邵曉梅 方劍喬

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

電針干預(yù)慢性炎性痛大鼠痛情緒的前扣帶皮層PKCζ調(diào)控機(jī)制

溫存 杜俊英 房軍帆 樂小琴 付桃芳 肖婷 邵曉梅 方劍喬

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

[目的]觀察電針對(duì)完全弗氏佐劑（Complete Freund's adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的慢性炎性痛大鼠痛情緒行為的干預(yù)作用及其對(duì)前扣帶皮層（Anterior Cingulate Cortex，ACC）內(nèi)蛋白激酶Cζ（Protein Kinase C zeta，PKCζ）的調(diào)控。[方法]將健康雄性SD大鼠完全隨機(jī)分為空白對(duì)照組（N組）、模型對(duì)照組（CFA組）和電針治療組（EA組），每組8只。建立慢性炎性痛模型，選取雙側(cè)“足三里”、“昆侖”穴進(jìn)行電針治療，每日1次，連續(xù)3天，檢測(cè)大鼠造模前及造模后ld、3d、7d、14d、21d、28d患側(cè)足跖縮足閾（paw withdrawal thresholds,PWTs），觀察大鼠痛覺超敏反應(yīng)。用曠場(chǎng)試驗(yàn)和高架O迷宮實(shí)驗(yàn)分別觀察大鼠造模后29d和30d情緒變化，免疫印跡法檢測(cè)大鼠雙側(cè)ACC內(nèi)PKCζ和磷酸化PKCζ（p-PKCζ）蛋白表達(dá)。[結(jié)果]造模前，各組大鼠PWTs差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后CFA組大鼠各時(shí)點(diǎn)PWTs均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EA組大鼠造模后28d PWTs明顯高于CFA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CFA組大鼠造模后29d中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯減少（P＜0.05），EA組大鼠中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CFA組造模后30d進(jìn)入開放臂次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CFA組患側(cè)PKCζ和p-PKCζ蛋白表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EA組大鼠雙側(cè)PKCζ和p-PKCζ蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。[結(jié)論]電針可減輕慢性炎性痛大鼠痛感覺和痛情緒行為，但其機(jī)制可能不是通過調(diào)節(jié)ACC中PKCζ表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

慢性炎性痛；痛情緒；電針；足三里；昆侖；疼痛；前扣帶皮層；PKCζ

國(guó)際疼痛學(xué)會(huì)認(rèn)為，“疼痛是一種與組織損傷或潛在的損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情緒體驗(yàn)”。疼痛包含感覺分辨和情緒反應(yīng)兩種成分，其中情緒反應(yīng)又可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩個(gè)階段。慢性疼痛是指持續(xù)時(shí)間超過半年以上的疼痛，是臨床上常見的癥狀之一，此類疾病的患病率較高，目前大約存在20%～30%的人群正在遭受慢性疼痛的傷害[1,2]，并且通常會(huì)伴有焦慮、抑郁等情緒障礙，逐步形成疼痛與痛情緒的惡性循環(huán)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，電針對(duì)慢性炎性疼痛均有不同程度的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[3,4]，而目前電針的研究主要還是痛感覺層面上，電針對(duì)痛情緒的研究相對(duì)落后。近幾十年的研究表明，前扣帶皮層（Anterior Cingulate Cortex，ACC）作為情緒腦環(huán)路的重要樞紐，在慢性痛情緒反應(yīng)中扮演著重要角色[5,6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體與痛情緒密切相關(guān)，蛋白激酶Cζ（Protein Kinase C zeta，PKCζ）作為N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate,NMDAR）等谷氨酸受體的激活和增強(qiáng)興奮性物質(zhì)[7]，在情緒方面發(fā)揮一定作用。研究人員研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）PKC抑制劑可改善患者精神狀態(tài)[8]。PKCζ是蛋白激酶家族PKC的成員之一，作為PKC非典型亞型蛋白，作者所在的團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，ACC腦區(qū)內(nèi)PKCζ參與慢性炎性痛痛情緒的調(diào)制[9]415。本文將繼續(xù)研究CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛痛情緒的變化情況，并運(yùn)用電針治療，觀察其對(duì)慢性炎性痛大鼠痛情緒行為的干預(yù)作用及其對(duì)ACC 中PKCζ活化的調(diào)控作用，初步探索電針干預(yù)痛情緒的ACC區(qū)域PKCζ調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠 (購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)24只，體質(zhì)量180±20g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，合格證號(hào)為SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料 (由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)及自由攝食與飲水，溫度（25±2）℃，濕度30%～40%，12h循環(huán)燈光 。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 PKCζ抗體：美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab59364；p-PKCζ抗體：美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab62372；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗：美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab6721；完全弗氏佐劑：美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBK1731V；HRP標(biāo)記的GAPDH(14C10)抗體：Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：3683；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：Beyotime公司，批號(hào)：P0010；Western blot ECL劑盒：Beyotime公司，批號(hào)：P0018；Western 及 IP細(xì)胞裂解液：Beyotime公司，批號(hào)：P0013；韓式穴位神經(jīng)刺激儀:HANS-200A，聯(lián)創(chuàng)科技南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司；華佗牌一次性針灸針:0.25mm×13mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：Image Quant LAS400型，德國(guó)GE公司；動(dòng)物視頻跟蹤系統(tǒng)：SMART V 3.0，深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3 分組與造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，完全隨機(jī)分為空白對(duì)照組（N組）、模型對(duì)照組（CFA組）、電針治療組（EA組）3組，每組8只。CFA組、EA組大鼠右后足足底皮下注射CFA（0.1ml/只），注射后24h局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，以建立慢性炎性痛模型[9]416；N組大鼠右后足足底皮下注射同等劑量的生理鹽水，以建立對(duì)照模型。

1.4 電針干預(yù) 造模后第28d檢測(cè)機(jī)械縮足閾前EA組大鼠開始介入電針治療。用0.25mm×13mm毫針針刺雙側(cè)“足三里”穴、“昆侖”穴，進(jìn)針后連接LH韓式穴位神經(jīng)刺激儀進(jìn)行電針刺激。干預(yù)參數(shù)：疏密波，頻率2/100Hz，強(qiáng)度起始1mA，10min后調(diào)為1.5mA，10min后再調(diào)為2mA，共30min，1次/d，連續(xù)處理3d。N組、CFA組不進(jìn)行電針干預(yù)，僅給予和EA組相同的固定。1.5 足跖縮足閾（paw Withdrawal Thresholds,PWTs）實(shí)驗(yàn)于造模前、造模后 ld、3d、7d、14d、21d、28d 7個(gè)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)大鼠患足PWTs的變化，測(cè)量時(shí)間固定在9：00-17：00，環(huán)境溫度為23℃左右。開始前先將大鼠放置于特定的鐵絲網(wǎng)上（UGO），蓋以透明有機(jī)玻璃照(20cm×20cm×15cm)，適應(yīng)環(huán)境直至大鼠安靜（即停止梳毛和探索性活動(dòng)），約15min。參考Chaplan[10]創(chuàng)建的經(jīng)典up and down法用Von Frey纖維絲（0.4g、0.6g、1.0g、2.0g、4.0g、6.0g、8.0g、15.0g和26.0g）測(cè)量。首先從4.0g開始，將Von Frey纖維絲置于大鼠右后足足底中央?yún)^(qū)皮膚(避開足墊)，輕微垂直用力至Von Frey絲彎曲成S形，刺激時(shí)間每次持續(xù)5-8s，間隔＞2min，若大鼠出現(xiàn)縮足/逃逸行為則陽性反應(yīng)，記為“X”，換小一級(jí)力度的Von Frey絲繼續(xù)刺激；反之以“O”表示，換大一級(jí)力度的Von Frey絲繼續(xù)刺激，直到出現(xiàn)第一對(duì)不同符號(hào)作為前兩個(gè)有效符(即“XO”或“OX”)之后再連續(xù)重復(fù)測(cè)量四次，如可得到“OOOXXOOX”的序列，以10xf+kδ/10000公式（xf=最后一個(gè)有效符號(hào)所在的Von Frey纖維絲上的log值，k=陰性或陽性反映符號(hào)排列所代表的值，δ=所有刺激強(qiáng)度log均差，該實(shí)驗(yàn)中是0.231）計(jì)算痛閾值，若連續(xù)5次測(cè)量均為陰性反應(yīng)則痛閾值為26g，反之若均為陽性反應(yīng)則痛閾值為0.4g。

1.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試 各組大鼠造模后29d電針干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行，操作間保持較暗的光線，避免直射光線，室溫25度左右，濕度適宜，環(huán)境安靜。先將待測(cè)大鼠放入實(shí)驗(yàn)環(huán)境中2h以適應(yīng)環(huán)境，調(diào)整好攝像頭，開始時(shí)將大鼠輕輕放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱正中格中（大鼠頭部背對(duì)實(shí)驗(yàn)者）即進(jìn)行攝像，記10min探索情況，用SMART V3.0動(dòng)物視頻跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行分析。分析時(shí)將曠場(chǎng)劃為16個(gè)格子，中間4個(gè)為中央?yún)^(qū)，其他12格為周圍區(qū)，計(jì)算10min內(nèi)大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間。每只大鼠測(cè)量前用10%酒精清洗方箱內(nèi)壁及底面以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.7 高架O迷宮試驗(yàn)測(cè)試 各組大鼠造模后30d電針干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行，環(huán)境要求及適應(yīng)條件同曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，開始時(shí)將大鼠迅速放置于迷宮閉合臂與開放臂交界處，其頭面向開放臂，記錄5min探索情況，使用SMART V3.0動(dòng)物視頻跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行分析，分析時(shí)將高架O迷宮分成4個(gè)臂，2個(gè)為閉合臂，2個(gè)為臂，計(jì)算5min內(nèi)大鼠在迷宮內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離、開放臂運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入開放臂的次數(shù)和開放臂停留時(shí)間百分比。每只大鼠測(cè)量前用10%酒精清洗方箱內(nèi)壁及底面以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.8 免疫印跡法檢測(cè)ACC內(nèi)PKCζ、p-PKCζ水平所有組別大鼠在造模后30d高架O迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即處死并取材:大鼠行水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔麻醉，參照 Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜快速取得左右兩側(cè)ACC，4℃生理鹽水經(jīng)心臟灌注，直至流出液體為澄清液體。冰上剪取雙側(cè)ACC，立即經(jīng)液氮速凍，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。各組雙側(cè)ACC分別放入離心管中稱量，加入1ml預(yù)冷的裂解液（碧云天RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、磷酸酶抑制劑），每10mg新鮮組織加入100μl裂解液，冰浴中充分超生粉碎，4℃冰箱中靜置0.5h后放入4℃高速離心機(jī)12000rpm離心10min，提取上清液測(cè)定量蛋白濃度。以20μg上樣量為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)各樣本的總蛋白濃度，計(jì)算蛋白上樣體積，加入等體積的2×上樣緩沖液，98℃水浴變性10min，采用10%SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠SDSPAGE，室溫聚合30min。電泳以每泳道20μg蛋白上樣量，先加至80V，約 40min，再調(diào)至120V約1h20min。電泳結(jié)束后用PVDF膜進(jìn)行半干轉(zhuǎn)印:恒壓15v，45min。轉(zhuǎn)印完將PVDF膜放在5%脫脂奶粉室溫封閉1h；加入相應(yīng)一抗(用TBST緩沖液稀釋)：兔抗大鼠PKCζ單克隆抗體（1:500）、兔抗大鼠p-PKCζ單克隆抗體（1:1000）和兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體（1: 1000），4℃孵育過夜，TBST緩沖液室溫?fù)u床上洗膜10min×3次；加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:5000),二抗室溫孵育1h，TBST緩沖液搖洗10min×3次；GAPDH直接顯色，拍片，其余用TBST緩沖液搖洗10min×3次；用Western blot ECL顯色液室溫避光反應(yīng)5min和ImageQuant LAS 4000凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍片；Image Quant TL軟件對(duì)目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值進(jìn)行分析，按相對(duì)灰度值=目的蛋白的灰度值/GAPDH灰度值，計(jì)算每組目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±s.e.m)表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；組間兩兩比較，方差齊性時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；均以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)CFA大鼠患側(cè)PWTs的影響 造模前各組間PWTs無明顯差異（P＞0.05）。 造模后1d，CFA組、EA組PWTs明顯低于同時(shí)間點(diǎn)N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示CFA成功誘發(fā)大鼠患側(cè)足趾痛覺異常。造模后第3d、7d、14d、21d和28d，CFA組大鼠PWTs均明顯低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明造模后的28d之內(nèi)大鼠一直處于CFA引起的痛覺異常過程中。 在造模后28d接受電針治療后，EA 組PWTs明顯高于同時(shí)點(diǎn)CFA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但是與同期N組大鼠無差異。見圖1。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)變化及電針的干預(yù) 造模后29d，與N組相比，CFA組大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)以及中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明CFA組大鼠出現(xiàn)情緒異常。與CFA組相比，EA組大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 三組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05），表明大鼠造模前后與治療前后探索能力無顯著區(qū)別。見圖2。

2.3 高架O迷宮觀察造模后不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)變化及電針的干預(yù) 造模后30d，與N組相比，CFA組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組總運(yùn)動(dòng)距離、開放臂運(yùn)動(dòng)距離和開放臂停留時(shí)間百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與CFA組相比，EA組各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖3。

圖1 各組大鼠患側(cè)足跖縮足閾各時(shí)點(diǎn)變化情況(±s.e.m,g)Fig.1 Comparison of the ipsilateral PWTs of rats in each group at each time point(±s.e.m,g)

圖2 D29電針對(duì)CFA大鼠曠場(chǎng)行為的影響Fig.2 Effect of EA on the open field test of rats on D29

2.4 電針對(duì)CFA大鼠雙側(cè)ACC內(nèi)PKCζ和p-PKCζ蛋白表達(dá)的影響 可見大鼠雙側(cè)ACC PKCζ和p-PKCζ條帶及其蛋白表達(dá)狀圖。造模后30d，與N組相比，CFA組大鼠患側(cè)PKCζ和p-PKCζ蛋白表達(dá)明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其健側(cè)PKCζ蛋白表達(dá)有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與CFA組相比，EA組的患側(cè)PKCζ、p-PKCζ蛋白表達(dá)有下降表現(xiàn)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其健側(cè)PKCζ、p-PKCζ蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4和圖5。

圖3 D30電針對(duì)CFA大鼠高架O迷宮行為的影響Fig.3 Effect of EA on the elevated O maze test of rats on D30

圖4 各組大鼠雙側(cè)ACC內(nèi)PKCζ蛋白的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative protein expression of PKCζ in bilateral ACC of rats in each group

3 討論

近幾年，CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛痛情緒改變相關(guān)研究得到了普遍的關(guān)注。足底注射CFA后可以產(chǎn)生持久而穩(wěn)定的炎性痛疼痛，成為經(jīng)典的慢性炎性痛模型。該模型伴發(fā)痛情緒行為學(xué)改變常見的實(shí)驗(yàn)方法有曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架O迷宮或十字迷宮實(shí)驗(yàn)、糖水試驗(yàn)、社交實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等。由于疼痛模型涵蓋了痛覺和痛情緒兩方面，因此評(píng)價(jià)需要從感覺和情緒兩方面闡述。研究表明經(jīng)典CFA注射模后1d縮足閾值達(dá)到最低，之后逐漸升高，至28d大鼠縮足閾值低于正常值[11]。另有研究表明CFA造模后2-4周大鼠出現(xiàn)痛情緒[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在痛感覺層面，模后1d明顯低于正常值，模后7d達(dá)到最低，至28d仍然持續(xù)疼痛，與經(jīng)典模型的持續(xù)時(shí)間一致。在痛情緒層面，慢性炎性痛大鼠中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離下降、進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間減少，提示大鼠產(chǎn)生了痛情緒。然而在本研究中，大鼠在高架O迷宮中僅有進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)減少，痛情緒產(chǎn)生不明顯，分析大鼠可能于模后28d為痛情緒產(chǎn)生的高峰。上述結(jié)果成功誘導(dǎo)了大鼠慢性炎性痛痛情緒模型。

圖5 各組大鼠雙側(cè)ACC內(nèi)p-PKCζ蛋白的相對(duì)表達(dá)Fig.5 Relative protein expression of p-PKCζ in bilateral ACC of rats in each group

目前，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)PKC超家族12個(gè)亞型，根據(jù)不同亞型在結(jié)構(gòu)和功能上的特點(diǎn)，可將PKC分為三組:經(jīng)典型PKC（conventional PKC，cPKC）、新奇型PKC(novel PKC，nPKC)和非經(jīng)典型PKC(atypical PKC，aPKC)，其中PKCζ因其與人的PKCι和鼠的PKCλ結(jié)構(gòu)相似，共同組成非典型PKC家族[13]。一般認(rèn)為，PKC以非活性分布于細(xì)胞溶質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞接收刺激時(shí)產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。DAG使PKC從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜，IP3使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+濃度升高，Ca2+使PKC構(gòu)象發(fā)生變化以利于其催化區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)被磷酸化從而導(dǎo)致PKC激活[14]。目前，多項(xiàng)研究表明PKC及其磷酸化形式p-PKC與情緒有關(guān):有研究發(fā)現(xiàn)ACC注射PKCζ抑制劑ZIP可抑制神經(jīng)損傷所致的痛情緒，但對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛閾無影響[15]。生理病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)素顆粒PKC磷酸化和谷氨酸受體PKC磷酸化在狂躁情緒中表達(dá)明顯增加，而使用抗興奮性藥物能減緩狂躁情緒的發(fā)展，并且患者大腦組織中p-PKC表達(dá)也顯著減少[16]。筆者之前的研究結(jié)果顯示：PKCζ及與慢性炎性疼痛痛情緒密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究觀察到造模后30d，患側(cè)PKCζ及其磷酸化形式蛋白p-PKCζ蛋白表達(dá)明顯增多，說明PKCζ的活化參與了慢性炎性疼痛形成，而這種疼痛的形成可能與增加PKCζ表達(dá)有關(guān)。

電針被廣泛用于各種疾病的治療。臨床上又以持續(xù)性或慢性疼痛治療效果更佳。目前現(xiàn)有的電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)和機(jī)制多從疼痛感覺的角度出發(fā)，主要通過離子通道、受體和相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)節(jié)蛋白的分析來闡述機(jī)理[17,18]。近來，大量臨床研究證明電針對(duì)不良情緒有良好的調(diào)節(jié)作用[19,20]。電針在緩解炎性痛的同時(shí)也緩解了大鼠的痛情緒[21,22]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，CFA慢性炎性痛模型成功建立后29d，EA組大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。表明電針在一定程度上可緩解CFA所致的痛情緒。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了電針對(duì)CFA大鼠ACC 內(nèi)PKCζ及其磷酸化形式蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示電針組的相對(duì)表達(dá)量與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，原因可能有以下情況：①大鼠樣本量不足導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大誤差，從而不能檢測(cè)到電針下調(diào)PKCζ和p-PKCζ蛋白表達(dá)的作用；②電針對(duì)PKCζ的干預(yù)作用可能不在ACC水平上。

綜上所述，電針對(duì)慢性炎性痛痛情緒大鼠存在一定的調(diào)節(jié)作用，但其調(diào)節(jié)機(jī)制與ACC水平PKCζ蛋白高表達(dá)不相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究電針對(duì)不同病理模型和動(dòng)物不同生理狀態(tài)下調(diào)節(jié)途徑可能有所不同，究竟電針是否是通過ACC內(nèi)PKCζ通路調(diào)節(jié)痛情緒還有待繼續(xù)研究，今后本團(tuán)隊(duì)也將繼續(xù)對(duì)慢性痛痛情緒行為及機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，為臨床治療慢性痛引發(fā)的情緒障礙提供一定的科學(xué)依據(jù)。

References:

[1] Wong WS,Fielding R.The co-morbidity of chronic pain, insomnia,and fatigue in the general adult population of Hong Kong:Prevalence and associated factors[J].Journal of Psychosomatic Research,2012,73(1):28-34.

[2] 張文祥,倪家驤.慢性疼痛與抑郁焦慮關(guān)系的研究進(jìn)展[J].疑難病雜志，2009，12(8)：764-766. ZHANG Wenxiang,NI Jiaxiang.Research Progress on the relationship between chronic pain and depression and anxiety[J].Chinese Journal of Difficult and Complicated Cases,2009,12(8):764-766.

[3]楊金蓉,宋開源,梁繁榮,等.電針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎區(qū)炎癥介質(zhì)含量的影響 [J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22 (1):48-49. YANG Jinrong,SONG Kaiyuan,LIANG Fanrong,et al. Effect of electroacupuncture on inflammatory media content in rats with adjuvant arthritis inflammation[J].Journal of Chengdu of Chinese medical University,1999,22(1):48-49.

[4]ZHANG Ruixin,LAO Lixing,REN Ke,et al.Mechanisms of Acupuncture-Electroacupuncture on Persistent Pain[J]. Anesthesiology,2011,120(2):482-503.

[5]CAO H,GAO YJ,REN WH,et al.Activation of extracellular signal-regulated kinase in the anterior cingulate cortex contributes to the induction and expression of affective pain[J].J Neurosci，2009,29(10):17-21.

[6] YAN N,GAO B,XU J,et al.Glutamatergic activation of anterior cingulate cortex mediates the affective component of visceral pain memory in rats[J].Neurobiol Learn Mem, 2012,97(1):64-156.

[7] 雷留根.痛厭惡“情緒”的神經(jīng)機(jī)制——相關(guān)的中樞結(jié)構(gòu)及谷氨酸受體[D].上海：中國(guó)科學(xué)院研究生院(上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)所)，2004：37-41. LEI Liugen.Neural mechanisms of emotional pain-related central structure and glutamate receptors[D].Shanghai: Chinese Academy of Sciences(Institute of Plant Physiology&Ecology),2004：37-41.

[8]XIAO Z，Jaiswal M，Deng PY，et al.Requirement of phospho-lipase C and protein kinase C in cholecystokininmediated facilitation of NMDA channel function and anxiety-like behavior[J].Hippocampus，2012，22(6):1438-1450.

[9] 杜俊英，溫存，邵曉梅，等.前扣帶皮層區(qū)域磷酸激酶Czeta在弗氏完全佐劑致炎性痛大鼠情緒反應(yīng)中的作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2016，24(4):415-421. DU Junying,WEN Cun,SHAO Xiaomei,et al.The role of PKCzeta-expression in the emotional response to complete Freund’s adjuvant-induced inflammatory pain[J]. ACTA Laboratorium Animalis Scientia Sinica,2016,24(4): 415-421.

[10]Chaplan S R,Bach F W,Pogrel J W,et a1.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].J Neurosci Meth,1994,53(1):55-63.

[11]REN K,Ronald D.Inflammatory Models of Pain and Hyperalgesia[J].Ilar J,1999,40(3):111-118.

[12]劉志文.加巴噴丁對(duì)慢性炎性痛大鼠引起的認(rèn)知功能改變和負(fù)性情緒的影響[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院研究所, 2012:1-26. LIU Zhiwen.The Effect of Gabapentin Administration on theCognitiveFunction Changeand NegativeEmotion Caused by Chronic Inflammation Pain Rats[D].Changsha：Study The institute of Second Xiangya Hospital of Central South Univerdity,2012:1-26.

[13]WU Jing,Liu Shuye,Fan Zhijuan，et al.A novel and selective inhibitor of PKC ζ potently inhibits human breast cancer metastasis in vitro and in mice[J].Tumor Biology, 2016,37(6):8391-8401.

[14]Takaaki Hirai,Kazuhiro Chida.Protein Kinase Cζ(PKCζ): Activation Mechanisms and Cellular Functions[J].J Biochem，2003,133(3):1-7.

[15]Fabien Marchand,Richard D’Mello,Ping K Yip，et al. Specific involvement of atypical PKCζ/PKMζ in spinalpersistent nociceptive processing following peripheral inflammation in rat[J].Molecular Pain,2011,7(86):1-18.

[16]LIU Huan,LIU ShenBin，LI Qian，et al.Downregulation of Spinal G Protein-Coupled Kinase 2 Abolished the Antiallodynic Effect of Electroacupuncture[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2015(10):1-7.

[17]King T,Qu C,Okun A,et a1.Contribution of PKMζdependent and in dependent amplification to components of experimental neuropathic pain[J].Pain,2012,153(6): 1263-1273.

[18]梁宜,方劍喬,房軍帆,等.中樞NMDA受體在疼痛中的作用及電針的干預(yù)研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,36(1): 109-112. LIANG yi,FANG Jianqiao,FANG Junfan,et al.Central NMDA in pain and intervention on ele-acupuncture[J]. Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2012,36 (1):109-112.

[19]Kondo T,Kawamoto M.Acupuncture and moxibustion for stress-related disorders[J].Biopsychosoc Med,2014,8(1): 1-7.

[20]Chen J,Lin W,Wang S,et al.Acupuncture/electroacupuncture enhances anti-depressant effect of Seroxat:the Symptom Checklist-90 scores[J].Neural Regen Res, 2014,9(2):213-22.

[21]LiQ,Yue N,Liu SB,etal.Effects ofchronic electroacupuncture on depression-and anxiety-like behaviors in rats with chronic neuropathic pain[J].Evid Based Complement Alternat Med,2014(2014):158987.

[22]Zhang Y,Meng X,Li A,et al.Acupuncture alleviates the affective dimension of pain in a rat model of inflammatory hyperalgesia[J].Neurochem Res,2011,36(11):2104-2010.

The Regulated Mechanism of Electroacupuncture on Emotional Pain with PKCζ in Anterior Cingulated Cortex of Rats with CFA Chronic Inflam－matory Pain

WEN Cun,DU Junying,FANG Junfan,et al The Third Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]To observe the intervention effect of electroacupuncture(EA)on pain-relative behaviour and it’s regulation of Protein Kinase C zeta (PKCζ)in anterior cingulated cortex(ACC)of rats with CFA chronic inflammatory pain.[Methods]Healthy male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into three groups:N group,CFA group and EA group,each group contained 8 rats.Rat chronic inflammatory pain model was established by CFA.EA was administered at bilateral points Zusanli(ST36)and Kunlun(BL60)once every day for consecutive 3 days.Paw withdraw thresholds(PWTs)were measured before CFA injection,as well as at 1,3,7,14,21,28 days after CFA injection.The open-field test and elevated-zero-maze test were respectively observed the emotional behavior of rats on 29d,30d.The protein expression of PKCζ and p-PKCζ in bilateral ACC was detected by western blot.[Result]There were no statistical significant differences of PWTs among the three groups before injecting CFA(P＞0.05).PWTs in CFA group was significantly lower at every time after CFA injection(P＜0.01).PWTs in EA group were significantly higher on 28d(P＜0.05).The distances in central zone,entries in central zone and times in central zone in CFA group on 29d were significantly lower than N group,with differences of statistical meaning(P＜0.05).The distances in central zone, entries in central zone and times in central zone in EA group were significantly higher(P＜0.01).Entries in open arms in CFA group on 30d were significantly lower(P＜0.05).The protein expression of PKCζ and p-PKCζ in ipsilateral ACC of CFA rats on 30d were increased with obvious significance(P＜0.05).The expression of PKCζ and p-PKCζ in contralateral ACC of EA rats didn’t have statistical significance(P＞0.05).[Conclusion]EA could relieve chronic inflammatory pain and pain-relative behaviour induced by CFA,but its mechanism might not be through adjusting the protein expression of PKCζ in ACC.

chronic inflammatory pain;emotional pain;electroacupuncture;Zusanli;Kunlun;pain;anterior cingulate cortex;PKCζ

R331

A

1005-5509（2017）01-0026-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.01.004

2016-09-30）

國(guó)家自然科學(xué)基金自助項(xiàng)目（81574056，81603690）；浙江省自然科學(xué)基金（LQ15H270003）；浙江省科技廳公益性（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)）（2016C37135）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目一般項(xiàng)目（2015KYB281）

Fund projects:Program was supported by national natural science foundation(81574056，81603690)；Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LQ15H270003)；Public Projects of Science Technology Department of Zhejiang Province(Laboratory animals Plant)(2016C37135)；Projects of medical and health technology common program in Zhejiang Province(2015KYB281)

方劍喬，E-mail:fangjianqiao7532@163.com；邵曉梅，E-mail:751257894@qq.com