李園園盛安琪施佳君壽旗揚(yáng)傅惠英

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

雷公藤皮質(zhì)部和木質(zhì)部對小鼠毒性反應(yīng)差異觀察

李園園2盛安琪3施佳君2壽旗揚(yáng)2傅惠英1

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

[目的]觀察雷公藤皮質(zhì)部和木質(zhì)部水提物對小鼠毒性反應(yīng)差異。[方法]將36只雌性ICR小鼠隨機(jī)分為雷公藤木質(zhì)部組、雷公藤皮質(zhì)部組和空白組。分別灌胃給予木質(zhì)部、皮質(zhì)部水提物和生理鹽水，1次/d，共19 d，期間記錄小鼠體重變化情況。末次給藥后，心臟取血，檢測小鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、尿酸（uric acid，UA）及血常規(guī)；HE染色觀察小鼠小腸、肝和腎組織形態(tài)學(xué)的改變。[結(jié)果]與空白組相比，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠體重顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），出現(xiàn)明顯的體征變化，血清ALT、AST、SCr、UA均有不同程度的升高（P＜0.05，P＜0.01），血常規(guī)多項(xiàng)指標(biāo)發(fā)生異常；病理觀察顯示雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠的腸壁顯著變?。≒＜0.05，P＜0.01），小腸、肝和腎組織形態(tài)均受到了一定程度的損傷，且木質(zhì)部組更為嚴(yán)重。[結(jié)論]雷公藤皮質(zhì)部和木質(zhì)部具有相似的腸、肝、腎毒性，可以考慮雷公藤皮質(zhì)部作為雷公藤提取物制劑原料。

雷公藤；木質(zhì)部；皮質(zhì)部；毒性

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.為衛(wèi)茅科雷公藤屬植物，近20年來，隨著對雷公藤化學(xué)成分及藥效毒理的深入研究，以雷公藤為原料制成的制劑具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用，廣泛用于治療類風(fēng)濕、紅斑狼瘡、銀屑病、腎炎、腫瘤等各類疾病，市場需求量不斷擴(kuò)大，其野生資源遭受嚴(yán)重的破壞[1-3]。為保障雷公藤產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，積極開展雷公藤人工栽培及擴(kuò)大雷公藤的藥用部位等研究日益受到關(guān)注。

一般認(rèn)為，雷公藤根皮毒性較大，故常常將根皮去除后入藥。但近年來的研究表明，雷公藤的根皮同樣具有臨床應(yīng)用價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤根木質(zhì)部和根皮HPLC指紋圖譜上的峰數(shù)和峰形基本相同，但含量要高于木質(zhì)部[4]。課題組前期比較了雷公藤根木質(zhì)部和皮質(zhì)部6個(gè)主要單體成分，包括雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲等，也均高于木質(zhì)部，尤其是雷公藤紅素高達(dá)100多倍[5]，提示雷公藤根皮部可考慮作為雷公藤提取物制劑的原料來源。但目前對雷公藤根皮部的毒性研究報(bào)道較少，然而藥物毒性是新藥研發(fā)過程中的重要障礙，藥材用藥部位的不同可能會產(chǎn)生安全問題，進(jìn)而影響新藥制劑的安全性。為此，本實(shí)驗(yàn)觀察雷公藤木質(zhì)部和皮部水提物對小鼠毒性反應(yīng)差異，為進(jìn)一步擴(kuò)大雷公藤藥用部位提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 雷公藤藥材，2015年5月份從浙江金華山上新鮮采挖。剝離雷公藤皮部和木質(zhì)部，曬干，切段。取等量藥材水煮2次，1h/次，合并濾液，濃縮。

1.2 試劑 10%中性緩沖甲醛：37%甲醛與0.01mol· L-1磷酸緩沖液1:9配制；蘇木素染液和0.5%伊紅染液配制（自配），用于組織切片的HE染色。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood ureanitrogen，BUN）、 血 清 肌 酐（serum creatinine，SCr）、尿酸（uric acid，UA）等試劑盒均購自上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司，批號分別為：07195/00001949、07218/00001951、07139/00001763、171035/50002289、07192/00001987。

1.3 動物 健康雌性ICR小鼠（SPF）36只，8周齡，體質(zhì)量20g左右，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.4 儀器 AG204-電子分析天平（瑞士METTLER）；日立7020全自動生化分析儀（日立公司）；STP120脫水機(jī)、AP280-2包埋機(jī)、HM335E切片機(jī)（MICROM公司）；MLS-3020高壓滅菌鍋（日本三洋公司）；BG-270隔水式電熱恒溫箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）；ADVIAR 2120i血液分析儀（西門子公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 將36只小鼠隨機(jī)分為3組，雷公藤木質(zhì)部組12只，雷公藤皮質(zhì)部組12只，空白組12只。各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。灌胃給藥，根據(jù)文獻(xiàn)[6]雷公藤臨床等效量為3.25g·kg-1，雷公藤根皮部毒性甚于木質(zhì)部，本實(shí)驗(yàn)取臨床等效量的近8倍量，按生藥計(jì)雷公藤皮質(zhì)部組劑量為12g·kg-1，雷公藤木質(zhì)部組劑量為24g·kg-1，空白組給予等體積的生理鹽水，各組均1次/d，連續(xù)19d。每日觀察小鼠大便性狀，毛色、活動及體重變化情況。

2.2 對小鼠肝、腎、腸組織形態(tài)的影響 肉眼觀察小鼠腸組織腸壁厚度及粘膜的變化。分別取新鮮肝、腎、適當(dāng)長度腸組織于甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3 對小鼠肝、腎功能的影響 各組動物末次給藥后，用0.3%的戊巴比妥鈉（0.015mL·g-1）腹腔麻醉，心臟取血。將血液靜置30min，3000r/min離心10min，取血清，全自動生化分析儀測定ALT、AST、BUN、SCr、UA及血常規(guī)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 給藥7d后，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠食欲降低，大便開始呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，偏潮濕，小鼠活動量減少，無力；空白組小鼠進(jìn)食及大便正常，健康活潑，未見異常。末次給藥后剖腹觀察，肉眼可見雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠腸壁明顯變薄、透明，空白組小鼠腸道未見異常。

3.2 雷公藤木質(zhì)部及皮質(zhì)部水提物對小鼠體重的影響 與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠給藥第7d后體重均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），且雷公藤皮質(zhì)部組小鼠體重較雷公藤木質(zhì)部組下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

3.3 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠血常規(guī)的影響 與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組嗜酸性細(xì)胞數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），單核細(xì)胞數(shù)和平均血紅蛋白濃度均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白組比較，雷公藤皮質(zhì)部組中性粒細(xì)胞顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與雷公藤木質(zhì)部組比較，雷公藤皮質(zhì)部組血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而網(wǎng)織紅細(xì)胞分布寬度和網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白分布寬度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠體重影響Fig.1 The effect on body weight of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

圖2 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠血常規(guī)影響Fig.2 The blood test of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

3.4 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠小腸及肝、腎功能的影響 對小鼠腸壁觀察顯示：與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠腸壁厚度均顯著變薄（P＜0.05，P＜0.01），且雷公藤木質(zhì)部組較雷公藤皮質(zhì)部組嚴(yán)重（P＜0.05）；對小鼠肝、腎功能檢測顯示：與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組ALT、AST、SCr和UA含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），但雷公藤木質(zhì)部組與皮質(zhì)部組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠肝、腎功能的影響Fig.3 The effects on function of liver and kidney of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

3.5 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠肝、腎及腸組織形態(tài)學(xué)影響

3.5.1 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠腸道組織形態(tài)學(xué)影響 對小腸組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：空白組小鼠腸道組織外觀無異常，結(jié)構(gòu)清晰，鏡下觀察小腸粘膜完整，固有層內(nèi)腸腺豐富，排列緊密；與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠小腸腸壁變薄，鏡下觀察粘膜壞死脫落，粘膜及粘膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺體細(xì)胞大量消失，且雷公藤木質(zhì)部組病變更為嚴(yán)重。見圖4。

圖4 各組小鼠小腸組織病理結(jié)果（HE，100×）Fig.4 The pathological section of small intestinum tissue in mice(HE,100×)

3.5.2 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠肝組織形態(tài)學(xué)影響 對小鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：空白組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)清晰，小葉中央靜脈結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，匯管區(qū)清晰可見；與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)一定的脂肪變性、水腫及散在嗜酸性變，肝竇部分消失，肝細(xì)胞排列不規(guī)則，且雷公藤木質(zhì)部組病變更為嚴(yán)重。見圖5。

3.5.3 雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物對小鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響 對小鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：空白組小鼠腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)完好，未見上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞增生等病理變化；與空白組比較，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組小鼠腎臟腎小球明顯增大，腎小囊變窄，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞增生，并有腎小球發(fā)生球囊粘連，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性，腎間質(zhì)內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤。見圖6。

4 討論

圖5 各組小鼠肝組織病理結(jié)果（HE，200×）Fig.5 The pathological section of liver tissue in mice(HE,200×)

圖6 各組小鼠腎組織病理結(jié)果（HE，100×）Fig.6 The pathological section of kidney tissue in mice(HE,100×)

雷公藤在臨床應(yīng)用中致消化系統(tǒng)的不良反應(yīng)發(fā)生率較高，其損害在正常劑量范圍內(nèi)即可發(fā)生，多表現(xiàn)為嘔吐、腹痛腹瀉、納差、腹脹等[7]。本實(shí)驗(yàn)通過對小鼠大便、小腸厚度和組織形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部均可以導(dǎo)致小鼠腹瀉、腸道壁變薄，腸絨毛破損等嚴(yán)重不良反應(yīng)，且雷公藤木質(zhì)部更為嚴(yán)重；但在體重指標(biāo)上，雷公藤皮質(zhì)部較木質(zhì)部顯著的降低了小鼠體重，提示皮質(zhì)部可能通過降低機(jī)體的營養(yǎng)吸收使小鼠體重減輕。

雷公藤有骨髓抑制作用，可引起白細(xì)胞及血小板減少，嚴(yán)重者可發(fā)生粒細(xì)胞缺乏、貧血和再生障礙性貧血[8]，本實(shí)驗(yàn)通過對給予雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物小鼠血常規(guī)觀察，發(fā)現(xiàn)兩者對白細(xì)胞總數(shù)影響不明顯，但嗜酸性細(xì)胞比率增高，這可能跟藥物引起機(jī)體過敏反應(yīng)有關(guān)，包括雷公藤皮質(zhì)部引起的中性粒細(xì)胞顯著升高；單核細(xì)胞比率降低，可能跟藥物抑制骨髓作用有關(guān)。此外，雷公藤木質(zhì)部血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量極其顯著下降，提示雷公藤木質(zhì)部對骨髓造血系統(tǒng)影響較雷公藤皮質(zhì)部明顯。

肝臟是雷公藤最主要和損傷最嚴(yán)重的毒性靶器官之一，雷公藤引起肝損害的臨床表現(xiàn)類似于急性病毒性肝炎，病理可見肝實(shí)質(zhì)性改變，細(xì)胞排列紊亂等現(xiàn)象[9]；常規(guī)劑量很少發(fā)生腎毒性，極少數(shù)患者在服藥1個(gè)月～2個(gè)月后出現(xiàn)面部浮腫、蛋白尿、紅細(xì)胞管型、肌酐和尿素氮升高[10]。本實(shí)驗(yàn)對給予雷公藤木質(zhì)部和皮質(zhì)部水提物小鼠ALT、AST、SCr、UA的檢測發(fā)現(xiàn)，肝、腎功能均有不同程度的損傷，但兩者之間無明顯差異。病理形態(tài)學(xué)顯示，雷公藤木質(zhì)部組和皮質(zhì)部組的肝、腎均發(fā)生一定程度的病變，雷公藤木質(zhì)部組尤為明顯。

綜上所述，雷公藤皮質(zhì)部在有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高雷公藤于木質(zhì)部情況下，對小腸、血常規(guī)及肝腎功能的毒性與雷公藤木質(zhì)部比較并沒有顯著差異，因此可以考慮作為雷公藤提取物制劑原料使用；但雷公藤皮質(zhì)部組在體重方面顯著低于雷公藤木質(zhì)部，提示雷公藤皮質(zhì)部可能還有其他關(guān)鍵毒性作用部位，有待進(jìn)一步深入研究。

References:

[1] 胡攀勇,李振麟,濮社班,等.雷公藤研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源,2013,32(2):1-3，7. HU Panyong,LI zhenlin,PU Sheban,et al.Research Advances on Triptreygium wilfordii[J].China Wild PlantResources,2013,32(2):1-3，7.

[2] 張鑫,武禎,李航.雷公藤多甙片藥理學(xué)研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J].臨床藥物治療雜志,2014,12(4):8-13. ZHANG Xin,WU Zhen,LI Hang.A Review of Pharmacological Research Progress and Clinical Use on Multiglycoside of Tripterygium Wilfordii Hook,f Tablet[J].Clinical Medication Journal,2014,12(4):8-13.

[3] 薛冠明,薛蕾,閆德友.雷公藤化學(xué)成分、生物活性及其資源利用概述[J].青海農(nóng)林科技,2013（4）:24-28. XUE Guanming,XUE Lei,YAN Deyou.A Overview of Chemical Ingredient,Biological Activity and Resource U-tilization of Tripterygium wilfordii[J].Science and Technology of Qinghai Agriculture and Forestry,2013（4）:24-28.

[4] 林文津,于虹敏,徐榕青,等.雷公藤根木質(zhì)部與根皮HPLC指紋圖譜比較研究[J].藥物分析雜志,2013,33(3):419-423. LIN Wenjin,YU Hongmin,XU Rongqing,et al.Fingerprint chromatogram analysis of the root xylems and root barks from Tripterygium wilfordii Hook.F.by HPLC[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2013,33(3):419-423.

[5] 張少燕,范永升,沈煒,等.雷公藤不同部位中6個(gè)單體成分的含量比較[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,5(31):1122-1125. ZHANG Shaoyan,FANG Yongsheng,SHEN Wei,et al. Comparative Study on Six Monomer Compositions in DifferentParts of Tripterygium wilfordill Hook.F[J].Chinese ArchivesofTraditionalChinese Medicine,2013,5(31): 1122-1125.

[6] 王蓓,陳晨,余黎,等.雷公藤不同提取部位對小鼠肝腎的損傷作用[J].中國中醫(yī)急癥,2012,21(3):383-385. WANG Bei,CHEN Chen,YU Li,et al.Research of Different Extractions of Tripterygium on Hepatic and Kidney Injury on Mice[J].Journal of Emergency in Traditional Chinese Medicine,2012,21(3):383-385.

[7] 張賀,王芳,葛平,等.雷公藤不良反應(yīng)及其配伍減毒增效研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(8):126-129. ZHANG He,WANG Fang,GE Ping,etal.Research Progress on the Toxicity of Tripterygium Wilfordii and Attenuated Synergistic Approaches[J].Chinese Journal of Information on TCM,2014,21(8):126-129.

[8] 黃明來,馬卓.雷公藤的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程,2012, 29(7):1-4. HUANG Minglai,MA Zhuo.The Research Progress of Tripterygium Wilfordii[J].Chemistry and Bioengineering,2012, 29(7):1-4.

[9] 曹玲娟,顏苗,李煥德,等.雷公藤致肝損傷及與甘草配伍減毒機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2015,40(13):2537-2541. CAO Lingjuan,YAN Miao,LI Huande,et al.Progress on mechanism of Tripterygium wilfordii-induced liver injury and detoxification mechanism of licorice[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2015,40(13):2537-2541.

[10]高麗,白赟,柴智,等.雷公藤毒性反應(yīng)研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2012,19(4):107-110. GAO Li,BAI Yun,CHAI Zhi,et al.Research Progress on toxicity of the toxic reaction of the hook[J].Chinese Journal of Information on TCM,2012,19(4):107-110.

The Toxic Effects of Tripterygium Wilfordii Root Cortex and Xylem Extraction on Mice

LI Yuanyuan,2SHENG Anqi3,SHI Jiajun2,et al 1.The Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053);2.Laboratory Animal Research Center of Zhejiang Chinese Medical University;3.College of Pharmacy of Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To observe the toxic effects of the tripterygium wilfordii cortex and xylem water extract on mice.[Methods]36 female ICR mice were randomly divided into three groups:tripterygium wilfordii xylem extract group,tripterygium wilfordii cortex extract group and control group,intragastric administration once per day for total 19 days.Record the changes of body weight in mice,and take heart blood to detect alanine aminotransterase(ALT), aspartate aminotransferase(AST),urea nitrogen(BUN),serum creatinine(SCr),uric acid(UA)and routine blood with the last administration;HE staining to observe the liver,kidney and intestine tissue morphology changes.[Results]Compared with the control group,the weight of tripterygium wilfordii group and xylem cortex group of mice decreased significantly(P＜0.05,P＜0.01),there were obvious body sign changes with administration.ALT,AST,SCr,UA were markedly increased(P＜0.05,P＜0.01);Routine blood showed anomalies;Pathological histology observation showed intestinal wall significantly got thinner(P＜0.05,P＜0.01);Parenchymal cells of intestines,liver,kidney tissues were damaged with various degree,especially for xylem group.[Conclusion]Tripterygium wilfordii cortex and xylem have similar intestines,liver and kidney toxicity,which suggests tripterygium wilfordii cortex can be used as raw material for tripterygium wilfordii preparation

Tripterygium wilfordii;xylem;cortex;toxicity

R331

A

1005-5509（2017）01-0082-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.01.018

2016-09-12）

浙江省中醫(yī)藥管理局（2014ZQ013）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13H280005）

Fund projects:Administration ofTraditionalChinese Medicine ofZhejiang Province(2014ZQ013);NaturalScience Foundtion of Zhejiang Province(LY13H280005)

傅惠英，E-mail:fhy131@126.com