李園園盛安琪施佳君壽旗揚傅惠英

1.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心3.浙江中醫(yī)藥大學藥學院

雷公藤皮質部和木質部對小鼠毒性反應差異觀察

李園園2盛安琪3施佳君2壽旗揚2傅惠英1

1.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心3.浙江中醫(yī)藥大學藥學院

[目的]觀察雷公藤皮質部和木質部水提物對小鼠毒性反應差異。[方法]將36只雌性ICR小鼠隨機分為雷公藤木質部組、雷公藤皮質部組和空白組。分別灌胃給予木質部、皮質部水提物和生理鹽水，1次/d，共19 d，期間記錄小鼠體重變化情況。末次給藥后，心臟取血，檢測小鼠丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、尿酸（uric acid，UA）及血常規(guī)；HE染色觀察小鼠小腸、肝和腎組織形態(tài)學的改變。[結果]與空白組相比，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠體重顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），出現明顯的體征變化，血清ALT、AST、SCr、UA均有不同程度的升高（P＜0.05，P＜0.01），血常規(guī)多項指標發(fā)生異常；病理觀察顯示雷公藤木質部組和皮質部組小鼠的腸壁顯著變薄（P＜0.05，P＜0.01），小腸、肝和腎組織形態(tài)均受到了一定程度的損傷，且木質部組更為嚴重。[結論]雷公藤皮質部和木質部具有相似的腸、肝、腎毒性，可以考慮雷公藤皮質部作為雷公藤提取物制劑原料。

雷公藤；木質部；皮質部；毒性

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.為衛(wèi)茅科雷公藤屬植物，近20年來，隨著對雷公藤化學成分及藥效毒理的深入研究，以雷公藤為原料制成的制劑具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用，廣泛用于治療類風濕、紅斑狼瘡、銀屑病、腎炎、腫瘤等各類疾病，市場需求量不斷擴大，其野生資源遭受嚴重的破壞[1-3]。為保障雷公藤產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，積極開展雷公藤人工栽培及擴大雷公藤的藥用部位等研究日益受到關注。

一般認為，雷公藤根皮毒性較大，故常常將根皮去除后入藥。但近年來的研究表明，雷公藤的根皮同樣具有臨床應用價值。有文獻報道雷公藤根木質部和根皮HPLC指紋圖譜上的峰數和峰形基本相同，但含量要高于木質部[4]。課題組前期比較了雷公藤根木質部和皮質部6個主要單體成分，包括雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲等，也均高于木質部，尤其是雷公藤紅素高達100多倍[5]，提示雷公藤根皮部可考慮作為雷公藤提取物制劑的原料來源。但目前對雷公藤根皮部的毒性研究報道較少，然而藥物毒性是新藥研發(fā)過程中的重要障礙，藥材用藥部位的不同可能會產生安全問題，進而影響新藥制劑的安全性。為此，本實驗觀察雷公藤木質部和皮部水提物對小鼠毒性反應差異，為進一步擴大雷公藤藥用部位提供依據。

1 材料

1.1 藥物 雷公藤藥材，2015年5月份從浙江金華山上新鮮采挖。剝離雷公藤皮部和木質部，曬干，切段。取等量藥材水煮2次，1h/次，合并濾液，濃縮。

1.2 試劑 10%中性緩沖甲醛：37%甲醛與0.01mol· L-1磷酸緩沖液1:9配制；蘇木素染液和0.5%伊紅染液配制（自配），用于組織切片的HE染色。丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood ureanitrogen，BUN）、 血 清 肌 酐（serum creatinine，SCr）、尿酸（uric acid，UA）等試劑盒均購自上海申能-德賽診斷技術有限公司，批號分別為：07195/00001949、07218/00001951、07139/00001763、171035/50002289、07192/00001987。

1.3 動物 健康雌性ICR小鼠（SPF）36只，8周齡，體質量20g左右，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.4 儀器 AG204-電子分析天平（瑞士METTLER）；日立7020全自動生化分析儀（日立公司）；STP120脫水機、AP280-2包埋機、HM335E切片機（MICROM公司）；MLS-3020高壓滅菌鍋（日本三洋公司）；BG-270隔水式電熱恒溫箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）；ADVIAR 2120i血液分析儀（西門子公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 將36只小鼠隨機分為3組，雷公藤木質部組12只，雷公藤皮質部組12只，空白組12只。各組小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。灌胃給藥，根據文獻[6]雷公藤臨床等效量為3.25g·kg-1，雷公藤根皮部毒性甚于木質部，本實驗取臨床等效量的近8倍量，按生藥計雷公藤皮質部組劑量為12g·kg-1，雷公藤木質部組劑量為24g·kg-1，空白組給予等體積的生理鹽水，各組均1次/d，連續(xù)19d。每日觀察小鼠大便性狀，毛色、活動及體重變化情況。

2.2 對小鼠肝、腎、腸組織形態(tài)的影響 肉眼觀察小鼠腸組織腸壁厚度及粘膜的變化。分別取新鮮肝、腎、適當長度腸組織于甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色光鏡觀察組織形態(tài)學變化。

2.3 對小鼠肝、腎功能的影響 各組動物末次給藥后，用0.3%的戊巴比妥鈉（0.015mL·g-1）腹腔麻醉，心臟取血。將血液靜置30min，3000r/min離心10min，取血清，全自動生化分析儀測定ALT、AST、BUN、SCr、UA及血常規(guī)。

2.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料用平均數±標準差（x±s）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，兩樣本間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 給藥7d后，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠食欲降低，大便開始呈現不規(guī)則形態(tài)，偏潮濕，小鼠活動量減少，無力；空白組小鼠進食及大便正常，健康活潑，未見異常。末次給藥后剖腹觀察，肉眼可見雷公藤木質部組和皮質部組小鼠腸壁明顯變薄、透明，空白組小鼠腸道未見異常。

3.2 雷公藤木質部及皮質部水提物對小鼠體重的影響 與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠給藥第7d后體重均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），且雷公藤皮質部組小鼠體重較雷公藤木質部組下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

3.3 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠血常規(guī)的影響 與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組嗜酸性細胞數均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），單核細胞數和平均血紅蛋白濃度均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與空白組比較，雷公藤皮質部組中性粒細胞顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與雷公藤木質部組比較，雷公藤皮質部組血小板、網織紅細胞均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而網織紅細胞分布寬度和網織紅細胞血紅蛋白分布寬度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠體重影響Fig.1 The effect on body weight of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

圖2 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠血常規(guī)影響Fig.2 The blood test of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

3.4 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠小腸及肝、腎功能的影響 對小鼠腸壁觀察顯示：與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠腸壁厚度均顯著變薄（P＜0.05，P＜0.01），且雷公藤木質部組較雷公藤皮質部組嚴重（P＜0.05）；對小鼠肝、腎功能檢測顯示：與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組ALT、AST、SCr和UA含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），但雷公藤木質部組與皮質部組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠肝、腎功能的影響Fig.3 The effects on function of liver and kidney of mice treatment with the cortex and xylem extract of common threewingnut root

3.5 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠肝、腎及腸組織形態(tài)學影響

3.5.1 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠腸道組織形態(tài)學影響 對小腸組織形態(tài)學觀察結果顯示：空白組小鼠腸道組織外觀無異常，結構清晰，鏡下觀察小腸粘膜完整，固有層內腸腺豐富，排列緊密；與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠小腸腸壁變薄，鏡下觀察粘膜壞死脫落，粘膜及粘膜下層有大量炎癥細胞浸潤，腺體細胞大量消失，且雷公藤木質部組病變更為嚴重。見圖4。

圖4 各組小鼠小腸組織病理結果（HE，100×）Fig.4 The pathological section of small intestinum tissue in mice(HE,100×)

3.5.2 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠肝組織形態(tài)學影響 對小鼠肝組織形態(tài)學觀察結果顯示：空白組小鼠肝臟結構清晰，小葉中央靜脈結構完整，肝細胞形態(tài)正常，匯管區(qū)清晰可見；與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠肝細胞出現一定的脂肪變性、水腫及散在嗜酸性變，肝竇部分消失，肝細胞排列不規(guī)則，且雷公藤木質部組病變更為嚴重。見圖5。

3.5.3 雷公藤木質部和皮質部水提物對小鼠腎組織形態(tài)學影響 對小鼠腎組織形態(tài)學觀察結果顯示：空白組小鼠腎小管和腎小球結構完好，未見上皮細胞和系膜細胞增生等病理變化；與空白組比較，雷公藤木質部組和皮質部組小鼠腎臟腎小球明顯增大，腎小囊變窄，內皮細胞和系膜細胞增生，并有腎小球發(fā)生球囊粘連，腎小管上皮細胞發(fā)生變性，腎間質內有炎癥細胞浸潤。見圖6。

4 討論

圖5 各組小鼠肝組織病理結果（HE，200×）Fig.5 The pathological section of liver tissue in mice(HE,200×)

圖6 各組小鼠腎組織病理結果（HE，100×）Fig.6 The pathological section of kidney tissue in mice(HE,100×)

雷公藤在臨床應用中致消化系統(tǒng)的不良反應發(fā)生率較高，其損害在正常劑量范圍內即可發(fā)生，多表現為嘔吐、腹痛腹瀉、納差、腹脹等[7]。本實驗通過對小鼠大便、小腸厚度和組織形態(tài)學觀察，發(fā)現雷公藤木質部和皮質部均可以導致小鼠腹瀉、腸道壁變薄，腸絨毛破損等嚴重不良反應，且雷公藤木質部更為嚴重；但在體重指標上，雷公藤皮質部較木質部顯著的降低了小鼠體重，提示皮質部可能通過降低機體的營養(yǎng)吸收使小鼠體重減輕。

雷公藤有骨髓抑制作用，可引起白細胞及血小板減少，嚴重者可發(fā)生粒細胞缺乏、貧血和再生障礙性貧血[8]，本實驗通過對給予雷公藤木質部和皮質部水提物小鼠血常規(guī)觀察，發(fā)現兩者對白細胞總數影響不明顯，但嗜酸性細胞比率增高，這可能跟藥物引起機體過敏反應有關，包括雷公藤皮質部引起的中性粒細胞顯著升高；單核細胞比率降低，可能跟藥物抑制骨髓作用有關。此外，雷公藤木質部血小板、網織紅細胞數量極其顯著下降，提示雷公藤木質部對骨髓造血系統(tǒng)影響較雷公藤皮質部明顯。

肝臟是雷公藤最主要和損傷最嚴重的毒性靶器官之一，雷公藤引起肝損害的臨床表現類似于急性病毒性肝炎，病理可見肝實質性改變，細胞排列紊亂等現象[9]；常規(guī)劑量很少發(fā)生腎毒性，極少數患者在服藥1個月～2個月后出現面部浮腫、蛋白尿、紅細胞管型、肌酐和尿素氮升高[10]。本實驗對給予雷公藤木質部和皮質部水提物小鼠ALT、AST、SCr、UA的檢測發(fā)現，肝、腎功能均有不同程度的損傷，但兩者之間無明顯差異。病理形態(tài)學顯示，雷公藤木質部組和皮質部組的肝、腎均發(fā)生一定程度的病變，雷公藤木質部組尤為明顯。

綜上所述，雷公藤皮質部在有效成分含量遠遠高雷公藤于木質部情況下，對小腸、血常規(guī)及肝腎功能的毒性與雷公藤木質部比較并沒有顯著差異，因此可以考慮作為雷公藤提取物制劑原料使用；但雷公藤皮質部組在體重方面顯著低于雷公藤木質部，提示雷公藤皮質部可能還有其他關鍵毒性作用部位，有待進一步深入研究。

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The Toxic Effects of Tripterygium Wilfordii Root Cortex and Xylem Extraction on Mice

LI Yuanyuan,2SHENG Anqi3,SHI Jiajun2,et al 1.The Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053);2.Laboratory Animal Research Center of Zhejiang Chinese Medical University;3.College of Pharmacy of Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To observe the toxic effects of the tripterygium wilfordii cortex and xylem water extract on mice.[Methods]36 female ICR mice were randomly divided into three groups:tripterygium wilfordii xylem extract group,tripterygium wilfordii cortex extract group and control group,intragastric administration once per day for total 19 days.Record the changes of body weight in mice,and take heart blood to detect alanine aminotransterase(ALT), aspartate aminotransferase(AST),urea nitrogen(BUN),serum creatinine(SCr),uric acid(UA)and routine blood with the last administration;HE staining to observe the liver,kidney and intestine tissue morphology changes.[Results]Compared with the control group,the weight of tripterygium wilfordii group and xylem cortex group of mice decreased significantly(P＜0.05,P＜0.01),there were obvious body sign changes with administration.ALT,AST,SCr,UA were markedly increased(P＜0.05,P＜0.01);Routine blood showed anomalies;Pathological histology observation showed intestinal wall significantly got thinner(P＜0.05,P＜0.01);Parenchymal cells of intestines,liver,kidney tissues were damaged with various degree,especially for xylem group.[Conclusion]Tripterygium wilfordii cortex and xylem have similar intestines,liver and kidney toxicity,which suggests tripterygium wilfordii cortex can be used as raw material for tripterygium wilfordii preparation

Tripterygium wilfordii;xylem;cortex;toxicity

R331

A

1005-5509（2017）01-0082-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.01.018

2016-09-12）

浙江省中醫(yī)藥管理局（2014ZQ013）；浙江省自然科學基金項目（LY13H280005）

Fund projects:Administration ofTraditionalChinese Medicine ofZhejiang Province(2014ZQ013);NaturalScience Foundtion of Zhejiang Province(LY13H280005)

傅惠英，E-mail:fhy131@126.com