劉厚明曾敏李全趙艷敏鄒婧林牧趙丹肖顏玉鄧群益單萬水★

embB基因突變與乙胺丁醇藥敏表型及耐多藥關(guān)系的研究

劉厚明1曾敏2李全2趙艷敏2鄒婧2林牧1趙丹3肖顏玉1鄧群益4單萬水1★

目的研究結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）embB306位點及其他突變位點與乙胺丁醇（ethambutol，EMB）的耐藥表型及耐多藥（multidrug resistant，MDR）的關(guān)系；分析embB基因突變與EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系。方法對臨床分離的MTB采用BD MGIT 960 SIRE試劑比例法進(jìn)行藥敏試驗，取48株EMB耐藥、46株EMB敏感但耐其他藥及7株四藥均敏感MTB提取核酸并擴(kuò)增embB基因全序列，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析embB基因序列，與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株序列比對，分析embB基因各突變位點、形式及頻率。結(jié)果101株MTB發(fā)現(xiàn)embB基因序列上有17個不同位點突變形式。53株MTB在embB基因序列上發(fā)生突變，其中46株為EMB耐藥，7株為EMB敏感；embB基因野生型的MTB有48株，其中2株為EMB耐藥，46株為EMB敏感；embB突變型與embB野生型的MTB之間EMB耐藥率有顯著性差異（χ2= 68.95，P＜0.01）。101株MTB中MDR有51株，其中有42株發(fā)生embB突變，9株為embB基因野生型，embB基因突變率在MDR和非MDR之間有顯著性差異（χ2=36.9，P＜0.01）。結(jié)論embB306位點與EMB耐藥及MDR中度相關(guān)，embB基因突變與EMB耐藥及耐多藥結(jié)核菌（multidrug resistant?Mycobacterium tuberculosis，MDR?TB）高度相關(guān)，embB基因突變可作為MDR?TB的檢測分子標(biāo)記物，指導(dǎo)臨床用藥。

結(jié)核分枝桿菌；embB基因；突變；乙胺丁醇；耐多藥

據(jù)世界衛(wèi)生組織2013年調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國的結(jié)核病患者約為85.5萬人，其中耐多藥（multi?drug resistant，MDR）結(jié)核病患者約為5.4萬人，我國的結(jié)核病和MDR結(jié)核病患病嚴(yán)重程度僅次于印度［1］，為世界第二大結(jié)核病和MDR結(jié)核病負(fù)擔(dān)大國，控制耐藥和MDR結(jié)核病的流行已經(jīng)成為中國結(jié)防工作的迫切任務(wù)。

乙胺丁醇（ethambutol，EMB）是治療結(jié)核病的一線用藥之一，EMB作用于靶分子阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，抑制了阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，從而影響MTB的細(xì)胞壁分枝菌酸?阿拉伯半乳聚糖?肽聚糖復(fù)合物的形成，發(fā)揮抑菌作用，使靶分子在細(xì)胞內(nèi)的藥物更容易進(jìn)入細(xì)胞，使聯(lián)合用藥發(fā)揮協(xié)同作用［2］。

目前大部分研究認(rèn)為MTB耐EMB與阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因embABC操縱子表達(dá)增高或突變有關(guān)，其中embB基因突變改變了阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)，從而引起耐藥［3］。Morkrouslv等［4］對embB306與臨床結(jié)核病的EMB耐藥關(guān)系之間研究顯示embB序列中306位點突變最常見（約48.3％的EMB耐藥和32.5％的EMB敏感但耐其他一線藥的MTB發(fā)生306位點突變），但是306位點以外的embB基因突變也可引起EMB耐藥，如在耐EMB分離株中，還可以檢測到如下基因位點突變：285Phe→Leu、330Phe→Val、630Thr→Ile等［4?6］，說明除306位點外還存在其他耐EMB MTB的基因突變位點。本研究對深圳市結(jié)核病患者分離的MTB embB基因全序列（3 297 bp）進(jìn)行測序分析，期許發(fā)現(xiàn)更多與耐EMB相關(guān)的embB突變位點，提高M(jìn)TB的EMB藥敏鑒定的準(zhǔn)確性，可有效控制耐EMB結(jié)核病和MDR的流行。

1 材料與方法

1.1 研究對象

對2013年1月至2014年5月來院就診結(jié)核病患者9 038份標(biāo)本進(jìn)行MTB的分離、培養(yǎng)和鑒定，共分離出MTB 2 243株，對其中865株進(jìn)行BD MGIT 960 SIRE液體藥敏試驗，選取所有EMB耐藥48株，占5.55％（48/865），取EMB敏感但耐其他藥46株，4種藥物全敏感7株，共計101株進(jìn)行研究。

1.2 藥物敏感性測定

使用在國際上作為MTB藥物敏感性檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”——比例法，嚴(yán)格按照BD MGIT 960 SIRE液體藥敏試驗操作說明書進(jìn)行，利福平（ri?fampin，RFP）、異煙肼（isonicazide，INH）、EMB和鏈霉素（streptomycin，SM）藥敏判讀折點濃度分別為1 mg/L、0.1 mg/L、5 mg/L和1 mg/L，結(jié)果判讀為耐藥（R）或敏感（S）。本文MDR是指至少同時耐利福平和異煙肼，多耐藥是指不同時耐利福平和異煙肼，但至少耐2種藥。

1.3 核酸提取

取MTB培養(yǎng)陽性菌懸液1 mL，80℃滅活60 min，13 300 rpm離心10 min，棄上清；沉淀用1 mL生理鹽水懸浮，13 300 rpm離心10 min，棄上清；重復(fù)上述步驟一次。沉淀加入50 μL去離子水，渦旋震蕩混勻，干浴鍋100℃×10 min，13 300 rpm離心10 min，離心后的上清即可作為PCR擴(kuò)增模板。

1.4 目的基因擴(kuò)增、測序及測序數(shù)據(jù)分析

將核酸提取物送至深圳華大基因研究院進(jìn)行目的基因擴(kuò)增測序及測序數(shù)據(jù)分析，根據(jù)M.tuber?culosis H37Rv菌株的標(biāo)準(zhǔn)參考序列（GenBank ac?cession no.NC_000962）設(shè)計embB基因全序列（3 297 bp）的PCR擴(kuò)增引物，上游引物（5′?3′）序列為AATCAGGCTCCAGACGC，下游引物（5′?3′）為TACCGAGCAGCATAGGAG。PCR反應(yīng)條件：（1）94℃，1 min預(yù)變性；（2）94℃，30 s變性；（3）58℃，30 s退火；（4）72℃，210 s延伸；（5）步驟（2）～（4）循環(huán)30次；（6）72℃，7 min；（7）12℃，保持。采用Sanger測序法對embB基因全序列進(jìn)行測序，利用軟件DNAstar Lasergene進(jìn)行序列拼接和與embB基因標(biāo)準(zhǔn)序列的比對，分析突變位點。本研究對embB基因的核苷酸或氨基酸位點均采用大腸桿菌的編號系統(tǒng)進(jìn)行描述。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)軟件為SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，兩組間的差異分析采用完全隨機(jī)設(shè)計的兩樣本率比較（卡方檢驗），P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比例法液體藥敏試驗結(jié)果

入選的101株MTB標(biāo)本比例法藥敏試驗，48例EMB耐藥和53例EMB敏感，其中MDR 51株，多重耐藥20株，結(jié)果見表1。

表1101 株MTB比例法藥敏結(jié)果Table 1Results of drug sensitivity of 101 strains of MTB by ratio method

2.2 基因測序及突變結(jié)果

本次研究發(fā)現(xiàn)embB序列上出現(xiàn)的基因突變位點一共有17個，已被錄入tbdreamdb結(jié)核分枝桿菌基因數(shù)據(jù)庫［7］的突變位點有306、406、534、328、497（Q→K，Q→R）和1 024位點。未被記錄入tbdreamdb MTB基因數(shù)據(jù)庫的突變位點有113、201、246、319、330、354、405、573、521、609和679位點以及Q497P、Q497H這2個堿基替換類型。306位點突變有27株菌，26株306位點突變樣本的藥敏表型為EMB耐藥，1株306位點突變的MTB藥敏為EMB敏感。497（Q→K，Q→H，Q→P）、406、328、354、330、319、405、1 024和521位點突變的MTB藥敏為EMB耐藥。246、679、113和534突變位點的MTB藥敏為EMB敏感。201和306位點在一個MTB上聯(lián)合突變，其藥敏為EMB耐藥；609和330位點在一個MTB上聯(lián)合突變，其藥敏為EMB敏感；246、497（Q→R）和573位點在一個MTB上聯(lián)合突變，其藥敏為EMB敏感。具體結(jié)果如表2所示。

2.3 基因突變與EMB藥敏相關(guān)性分析

101個檢測樣本中53株MTB發(fā)生embB基因突變，其中46株embB基因突變?yōu)镋MB耐藥，占86.8％（46/53），7株embB基因突變?yōu)镋MB敏感，占13.2％（7/53）；48株embB基因野生型MTB中耐EMB的只有2株，embB基因野生型MTB的EMB耐藥率為4.2％（2/48），46株embB基因野生型MTB為EMB敏感菌株。embB基因突變型與embB基因野生型MTB的EMB耐藥率進(jìn)行比較，有統(tǒng)計學(xué)意義，二者有顯著性差異，embB突變型MTB的EMB耐藥率明顯比embB野生型MTB的EMB耐藥率高。詳細(xì)結(jié)果見表3。

2.4 基因突變與MDR?TB相關(guān)性分析

根據(jù)表4，101個樣本中MDR?TB一共有51株，其中embB基因突變型的MDR?TB有42株，占82.3％（42/51）；embB基因野生型的MDR?TB有9株，占17.6％（9/51）。MDR?TB在embB基因突變型和embB基因野生型之間進(jìn)行比較，有統(tǒng)計學(xué)意義，二者有顯著性差異，embB基因突變率MDR?TB較非MDR?TB更高。詳細(xì)結(jié)果見表5。

3 討論

embB基因突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系：吳雪瓊等［2，5］相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)36％～69％的MTB耐EMB分離株有embB基因突變，本次研究深圳市MTB基因檢測結(jié)果顯示耐EMB的MTB分離株中embB基因突變檢出率為95.8％（46/48），深圳市MTB耐EMB的embB基因突變率更高。embB基因突變型與野生型EMB耐藥率有統(tǒng)計學(xué)意義，embB基因突變型比野生型EMB耐藥率明顯增高，提示embB基因突變與EMB耐藥密切相關(guān)，與大多數(shù)研究文獻(xiàn)的結(jié)論一致［5，8?12］。因此筆者認(rèn)為MTB發(fā)生embB基因突變與深圳地區(qū)的MTB耐EMB高度相關(guān)。

表2 embB各突變位點的氨基酸改變與MTB藥敏結(jié)果分析Table 2Analysis of amino acid change and MTB drug sensitivity ofembBin different mutation sites

Ramaswamy等［12］和Shi等［13］文獻(xiàn)指出embB基因突變可能是MDR流行的原因之一。本研究中，MDR?TB在embB基因突變型與野生型之間比較有統(tǒng)計學(xué)意義，embB基因突變型MTB MDR率明顯比野生型的MTB MDR率要高，提示embB基因突變與MDR之間高度相關(guān)。Shi等［13］在研究河南的結(jié)核病embB基因突變特征中發(fā)現(xiàn)138株MDR中119株MDR檢測到embB突變，突變率為86.2％（119/138），與本研究結(jié)果相似，因此，我們認(rèn)為embB基因突變可能是深圳市MDR?TB流行的主要原因之一，embB基因突變的檢出可以有效預(yù)測深圳市結(jié)核病的MDR情況。在尚未發(fā)現(xiàn)明確的MDR檢測分子標(biāo)記物之前，筆者認(rèn)為embB基因突變可作為診斷MDR?TB的檢測分子標(biāo)記物。

表3 embB基因突變型與embB基因野生型的MTB的EMB耐藥對比分析（株）Table 3Analysis of drug resistance of EMB betweenembBgene mutation and wild type in MTB(strains)

表4 MDR?TB藥敏情況統(tǒng)計Table 4Results of MDR?TB drug sensitivity

embB306位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系：近年來有大量的文獻(xiàn)和研究表明發(fā)生embB突變的EMB耐藥MTB中約有27％～87％的突變發(fā)生在306位點上［8?9，14?15］，本研究中，306位點突變菌株為27株，占embB基因突變位點樣本的49.3％（27/53），證實了embB306突變確實與MTB耐EMB有關(guān)，但并不能認(rèn)為embB306位點突變直接導(dǎo)致MTB耐EMB［13，15?17］。本研究單獨檢測embB306突變診斷MTB對EMB耐藥靈敏度54.2％（26/48），通過檢測embB基因所有突變位點，可以提高靈敏度至95.8％（46/48），這提示embB基因上多個位點均可能參與了MTB的EMB耐藥發(fā)生，與Shi等［13］的研究結(jié)論一致。306位點突變檢測EMB耐藥性在臨床應(yīng)用上有一定的局限性，但該位點是目前MTB耐EMB的最高頻突變位點。本研究被檢測到embB306位點突變的MTB的EMB耐藥率96.3％（26/27），特異度98.1％（52/53），306位點的檢出提示該菌株對EMB耐藥中度相關(guān)。embB基因突變檢測和306位點檢測都可用于臨床MTB的EMB耐藥的預(yù)測，embB基因檢測與306位點檢測聯(lián)合應(yīng)用可提高診斷的靈敏度和特異度，可使MTB的EMB藥敏結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

Safi等［18］的研究以及在筆者［19］以前研究的embB306位點與MDR相關(guān)性結(jié)論認(rèn)為embB306不僅與EMB耐藥相關(guān)，與其他3種一線藥物RFP、INH和SM也有相關(guān)，本研究embB306位點突變MTB的MDR率為81.5％（22/27），embB306位點與MDR相關(guān)。張楠等［20］研究認(rèn)為306位點可以作為MDR?TB的檢測分子標(biāo)志物，本研究結(jié)果顯示MTB發(fā)生embB306位點突變的MDR率為43.1％（22/ 51），306位點診斷MDR?TB的靈敏度較低，因此，我們認(rèn)為306位點作為MDR?TB的檢測分子標(biāo)志物可靠性一般；發(fā)生embB基因突變的MDR率為82.3％（42/51），306位點與其他突變位點聯(lián)合應(yīng)用可提高M(jìn)DR檢測方法的靈敏度，306位點是embB基因上與MDR?TB相關(guān)的一個重要的突變位點在實驗室診斷EMB耐藥和MDR?TB中有較高的參考價值。

表5 embB基因突變型與embB基因野生型的MDR?TB情況對比分析（單位：株）Table 5Analysis of MDR?TB between embB gene mutation and wild type(strains)

embB406和497位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系：有相關(guān)研究表明406和497位點是除306位點以外在embB基因上被發(fā)現(xiàn)最多的2個突變位點［15］，本研究結(jié)果與上述研究一致。本研究embB406位點突變株EMB耐藥率為100％（5/5），MDR率為80％（4/5）；embB497突變株EMB耐藥率為83.3％（5/6），MDR率為83.3％（5/6）。406和497位點的EMB耐藥率和MDR率相當(dāng)高，近年來越來越多的研究顯示406和497位點與EMB耐藥相關(guān)［13，15，21?25］，406位點或497位點發(fā)生突變會導(dǎo)致MTB對EMB低濃度耐藥［23］，因此筆者認(rèn)為406位點和497位點突變與EMB耐藥高度相關(guān)，406位點、497位點和306位點都是診斷MTB耐EMB的重要檢測突變位點。

Xu等［15］研究認(rèn)為EMB耐藥的MTB突變發(fā)生在406或497位點上的均為MDR?TB，本研究結(jié)果與上述結(jié)論不完全相符，但多個研究顯示在MDR?TB中檢測到406或497位點突變的頻率在5％～ 15％之間［13，15，22，24］，我們的結(jié)果與之相符。筆者認(rèn)為emb406和embB497突變位點與MDR?TB耐一線藥相關(guān)，是除了306位點以外的另外2個與MDR?TB相關(guān)的重要embB突變位點，可應(yīng)用于臨床診斷MTB的EMB耐藥和MDR相關(guān)性的預(yù)測。

embB328、354和1024位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系：embB328、354這4個突變位點都被記錄入tbdreamdb數(shù)據(jù)庫，4個位點突變的MTB藥敏結(jié)果都是EMB耐藥，相關(guān)的研究顯示embB328［13，15，21，24，26］、354［13，15，21，26］和1024［13，21］位點都是在耐EMB的MTB被檢測到。本研究中，embB328位點突變的MTB有4個，embB354位點突變的MTB有2個，embB1024位點突變的MTB只有1個，這些突變的樣本都是MDR?TB，且都是耐EMB的MTB，筆者認(rèn)為他們與MTB對EMB耐藥及MDR?TB相關(guān)。單獨檢測一個embB306基因位點耐EMB的靈敏度為54.2％（26/48），聯(lián)合306、406、497、328、354和1024位點可提高靈敏度至81.3％（39/48），embB328、354和1024位點可應(yīng)用于預(yù)測MTB耐EMB和MDR相關(guān)性，為實驗室建立EMB耐藥檢測方法提供了理論依據(jù)。

embB405、521、330、319、534、246、113、679、201、609和573位點突變與MTB的EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系：以上突變位點突變株較少，突變位點未被記錄入tbdreamdb數(shù)據(jù)庫，或雖有記錄入tb?dreamdb數(shù)據(jù)庫，但相關(guān)文獻(xiàn)［13?15，21?24，27］研究沒有指出其突變與EMB藥敏表型及MDR的關(guān)系，結(jié)合本研究，尚不能確定以上突變位點與MTB的EMB耐藥及MDR之間的關(guān)系。

綜上所述，embB306位點與EMB耐藥及MDR中度相關(guān)，306位點突變檢測EMB耐藥和MDR在臨床應(yīng)用上有一定的局限性，與其它位點如embB406、497聯(lián)合應(yīng)用可提高檢測方法的靈敏度，在實驗室診斷EMB耐藥和MDR?TB中有較高的參考價值。embB基因突變與EMB耐藥及MDR高度相關(guān)，embB基因突變可作為MDR?TB的檢測分子標(biāo)記物。embB基因embB306、497、406、328、354、1024、319、330、405和521位點突變與EMB耐藥相關(guān)，認(rèn)為embB基因序列上900～1500位點之間是高頻突變區(qū)，與Shi等［13］的研究一致，該序列區(qū)域發(fā)生突變與EMB耐藥高度相關(guān)，我們將其命名為EMB耐藥決定區(qū)域（ethambutol resistance determining region，ERDR），為實驗室建立快速診斷MTB的EMB耐藥性和MDR的檢測方法提供了理論依據(jù)，為臨床對EMB耐藥MTB感染的治療具有指導(dǎo)意義。

［1］World Health Organization.Global Tuberculosis Report［R］.2013.

［2］吳雪瓊，張鐘德，樂軍.分枝桿菌分子生物學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：131?132.

［3］熊禮寬.結(jié)核病實驗室診斷學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：65.

［4］Mokrousov I，Otten T，Vyshnevskiy B，et al.Detec?tion of embB306 mutations in ethambutol?susceptible clinical isolate of mycobacterium tuberculosis isolates from northwestern Russia：implications for genotypic re?sistance testing［J］.J Clin Microbiol，2002，40（10）：3810?3813.

［5］吳雪瓊，梁建琴，李洪敏，等.結(jié)核桿菌耐乙胺丁醇分離株embB基因突變的研究［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2001，24（4）：214?216.

［6］Starks AM，Gumusboga A，Plikaytis BB，et al.Muta?tions at embB codon 306 are an important molecular in?dicator of ethambutol resistance in mycobacterium tu?berculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53（3）：1061?1066.

［7］Sandgren A，Strong M，Muthukrishnan P，et al.Tuber?culosis drug resistance mutation database［J］.Plos Med，2009，6（2）：132?136.

［8］Zofia B，Agnieszka N，Jacek B，et al.Mutations in the embB gene and their association with ethambutol resis?tance in multidrug?resistant mycobacterium tuberculo?sis clinical isolates from Poland［J］.BioMed Research International，2013，2013：167954.

［9］Sreenatsan S，Stockbauer KE，Pan X，et al.Ethambu?tol resistance in mycobacterium tuberculosis：critical role of embB mutations［J］.Antimicrob Agents Che?mother，1997，41（8）：1677?1681.

［10］Lee AS，Othman SN，Ho YM，et al.Novel mutations within the embB gene in ethambutol?susceptible clinical isolates of mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（11）：4447?4449.

［11］Zhang N，Torrelles JB，McNeil MR，et al.The Emb proteins of mycobacteria direct arabinosylation of lipo?arabinomannan and arabinogalactan via an N?terminal recognition region and a C?terminal synthetic region［J］.Mol Microbiol，2003，50（1）：69?76.

［12］Ramaswamy SV，Amin AG，Goksel S，et al.Molecu?lar genetic analysis of nucleotide polymorphisms associ?ated with ethambutol resistance in human isolates of my?cobacterium tuberculosis［J］.Antimicrob Agents Che?mother，2000，44（2）：326?336.

［13］Shi D，Li L，Zhao Y，et al.Characteristics of embB mutations in multidrug?resistant mycobacterium tuber?culosis isolates in Henan，China［J］.J Antimicrob Che?mother，2011，66（10）：2240?2247.

［14］Cheng S，Cui ZL，Li YY，et al.Diagnostic accuracy of a molecular drug susceptibility testing method for the antituberculosis drug ethambutol：a systematic review and meta?analysis［J］.J Clin Microbiol，2014，52（8）：2913?2924.

［15］Xu YH，Jia HY，Huang HR，et al.Mutations found in embCAB，embR，and ubiA Genes of ethambutol?sensi?tive and?resistant mycobacterium tuberculosis clinical isolates from China［J］.BioMed Research Internation?al，2015，2015：951706.

［16］丁海榕，秦川，占玲俊.部分抗結(jié)核分枝桿菌藥物的耐藥機(jī)理研究進(jìn)展［J］.中國防癆雜志，2013，35（8）：615?620.

［17］丁冰冰，馬駿，陳高瞻，等.武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株乙胺丁醇耐藥分子特征研究［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2013，32（2）：13?17.

［18］Safi H，Sayers B，Hazbon MH，et al.Transfer of embB codon 306 mutations into clinical mycobacterium tuberculosis strains alters susceptibility to ethambutol，isoniazid，and rifampin［J］.Antimicrob Agents Che?mother，2008，52（6）：2027?2034.

［19］劉厚明，肖顏玉，李天品，等.結(jié)核分枝桿菌embB基因306位點與乙胺丁醇藥敏表型與耐多藥關(guān)系的研［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2015，15（6）：731?734.

［20］張楠，胡繼紅，萬康林.乙胺丁醇耐藥表型與耐藥基因embB突變的關(guān)系［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（3）：490?492，571.

［21］Ali A，Hasan Z，McNerney R，et al.Whole genome se?quencing based characterization of extensively drug?re?sistant mycobacterium tuberculosis isolates from Paki?stan［J］.Plos One，2015，10（2）：e0117771.

［22］Elba G，Dihadenys L，Sergio Y，et al.Association be?tween embB mutations and ethambutol resistance in my?cobacterium tuberculosis isolates from Cuba and the Dominican Republic：reproducible patterns and prob?lems［J］.Revista Argentina de Microbiología，2013，45（1）：21?26.

［23］Safi H，F(xiàn)leischmann RD，Peterson SN，et al.Allelic exchange and mutant selection demonstrate that com?mon clinical embCAB gene mutations only modestly in?crease resistance to ethambutol in mycobacterium tuber?culosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（1）：103?108.

［24］Zhang ZJ，Wang YF，Pang Y，et al.Ethambutol re?sistance as determined by broth dilution method corre?lates better than sequencing results with embB muta?tions in multidrug?resistant mycobacterium tuberculo?sis isolates［J］.J Clin Microbiol，2014，52（2）：638?641.

［25］Plinke C，Cox HS，Zarkua N，et al.embCAB se?quence variation among ethambutol?resistant mycobac?terium tuberculosis isolates without embB306 mutation［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65（4）：1359?1367.

［26］劉志廣，孫慶，劉海燦，等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌中embB基因突變與乙胺丁醇耐藥的相關(guān)性研究［J］.疾病監(jiān)測，2015，30（4）：321?324.

［27］陳慶海，劉星，黃君富，等.結(jié)核分枝桿菌embB330co?don分子信標(biāo)雜交及熒光顯微觀測［J］.中華醫(yī)藥感染學(xué)雜志，2009，19（14）：1908?1910.

Assosciation between embB mutation and drug resistance and MDR in Mycobacterium tuberculosis for ethambutol

LIU Houming1,ZENG Min2,LI Quan2,ZHAO Yanmin2,ZOU Jing2,LIN Mu1,ZHAO Dan3,XIAO Yanyu1, DENG Qunyi4,SHAN Wanshui1★
(1.Department of Clinical Laboratory,the Third People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong, China,518112;2.Beijing Genomics Institute?Shenzhen,Shenzhen,Guangdong,China,518083;3.Department of Clinical Laboratory,Luohu Chronic Disease Prevention and Cure Hospital,Shenzhen,Guangdong,China, 518029;4.Department or Tuberculosis,the Third People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong, China,518112)

ObjectiveTo determine Mycobacterium tuberculosis(MTB)embB306 and other loci molecular mutations and their association with ethambutol(EMB)resistance phenotype and multidrug resistant (MDR);to determine molecular mutation in embB gene and its association with EMB resistance phenotype and MDR.MethodsThe drug sensitivity test was carried out using ratio method by BD 960 MGIT SIREreagent for clinical isolates of MTB,the DNA of 48 EMB resistance,46 EMB sensitive but resistance to other drugs and 7 sensitive to four drugs of MTB were extracted and amplified embB gene sequence.The amplified products were then sequenced and analyzed the embB gene sequence of each MTB,compared with H37Rv standard strain in Genbank,the mutation sites,the form and the frequency of embB gene were analyzed. Results17 different mutant forms were found in 101 strains of MTB embB gene.53 strains of MTB mutated in the embB gene,46 strains of which were EMB resistant,7 were EMB sensitive;48 strains of MTB were wild type in the embB gene,2 strains of which were EMB resistant,46 were EMB sensitive.There were significant differences in the drug resistance positive rates of EMB between embB mutation and embB wild type(χ2=68.95, P＜0.01).There were 51 strains MDR in 101 MTB,including 42 strains of embB mutation,and 9 strains of embB wildtype,the mutation rate of embB gene was significantly different between MDR and non?MDR(χ2= 36.9,P＜0.01).ConclusionembB 306 mutation is moderately related to EMB resistance in MTB,mutation of embB gene is highly associated with EMB resistance and MDR?TB,the embB gene can be used as a marker for the detection of MDR?TB,which could be used guideline for clinical drug use.

Mycobacterium tuberculosis;embB gene;Mutation;Ethambutol;MDR

深圳市科技創(chuàng)新委員會基金（JCYJ2013040116479996，JCYJ20140411113637598）；深圳市三名工程專項基金；深圳市科技研發(fā)資金（ZDSYS201504301534057）

1.深圳市第三人民醫(yī)院檢驗科，廣東，深圳518112 2.深圳華大基因研究院，廣東，深圳518083 3.深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院檢驗科，廣東，深圳518029 4.深圳市第三人民醫(yī)院肺病科，廣東，深圳518112

★通訊作者：單萬水，E?mail：shanwanshui152@aliyun.com