王秋實(shí)郝文波羅樹(shù)紅★

·綜述·

丙型肝炎免疫診斷的前景與優(yōu)勢(shì)

王秋實(shí)1郝文波2羅樹(shù)紅2★

丙型肝炎（hepatitis C，下稱丙肝或HC）缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，其篩查與確診依賴實(shí)驗(yàn)室診斷。近些年，隨著基因技術(shù)與免疫技術(shù)的發(fā)展，以及其在臨床診斷中的應(yīng)用實(shí)踐，對(duì)于丙型肝炎的診斷，有了許多新方法。本文從免疫、基因和臨床3方面介紹這些新型診斷方法，闡明免疫學(xué)診斷在臨床應(yīng)用上的前景與優(yōu)勢(shì)。

丙型肝炎病毒；診斷；免疫；基因

世界衛(wèi)生組織公布，世界范圍內(nèi)有1.7億丙肝患者，主要經(jīng)血液或血制品傳播［1］。未根治的丙肝會(huì)對(duì)肝臟造成慢性損害，有可能進(jìn)一步惡化為肝纖維化及肝硬化，加劇肝細(xì)胞的惡變導(dǎo)致肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。由于缺少疫苗，藥物療效差以及診斷時(shí)無(wú)特異性癥狀，丙肝成為了一種亟待解決的傳染性疾?。?］。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染的患者只有部分有明顯的臨床表現(xiàn)，有相當(dāng)一部分患者表現(xiàn)為隱性感染或成為攜帶者，對(duì)該病的診斷和預(yù)防造成了困難［3］。HCV基因組為單正鏈RNA，長(zhǎng)約9.5 kb，由5′端非編碼區(qū)、編碼區(qū)及3′端的非編碼區(qū)構(gòu)成。HCV的編碼區(qū)占基因組全長(zhǎng)的95％。僅含有單一的開(kāi)放讀碼框，編碼大小為3 010～3 033個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，該前體蛋白在病毒蛋白酶及宿主信號(hào)肽酶的作用下，切割為至少10個(gè)蛋白，其中3個(gè)為結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核心衣殼蛋白（core pro?teins，C），包膜蛋白1（envelope protein 1，E1）及包膜蛋白2（envelope protein 2，E2），6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non?structural protein2～5B，NS2～NS5B）。隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的進(jìn)步，以檢測(cè)HCV的特異基因和蛋白為基礎(chǔ)，出現(xiàn)了許多不同于傳統(tǒng)HCV診斷方法的新技術(shù)。本文意在從免疫診斷、基因診斷、臨床診斷3個(gè)方面介紹國(guó)內(nèi)外對(duì)于丙肝診斷的新方法、新思路。

1 免疫診斷

HCV從感染到特異抗體產(chǎn)生一般需要50～70天，相較于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real?time polymerase chain reaction，real?time PCR）定量檢測(cè)HCV RNA等基因診斷方法，現(xiàn)有的免疫學(xué)檢測(cè)在HCV早期診斷中存在一定缺陷，對(duì)預(yù)后的判斷也不如基因診斷準(zhǔn)確［4］。但其檢驗(yàn)成本遠(yuǎn)低于基因診斷等方法，有著廣泛的應(yīng)用前景。

1.1 檢測(cè)HCV核心抗原

HCV核心抗原水平與慢性丙肝患者HCV RNA感染水平相互對(duì)應(yīng)，常被用來(lái)作為HCV復(fù)制的間接標(biāo)志［5?8］。核心抗原是在所有HCV基因型中都很保守的結(jié)構(gòu)基因。量化HCV核心抗原檢驗(yàn)成本低，可以與HCV RNA檢測(cè)相互補(bǔ)充，并在諸多人群中得到驗(yàn)證［8?11］。該方法成本僅是PCR檢測(cè)RNA的1/10，適用于需反復(fù)檢測(cè)、長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)HCV感染的患者［12］。其中The Architect HCV Ag測(cè)定法（德國(guó)威斯巴登，雅培診斷）具有商業(yè)價(jià)值。該方法結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫與HCV定性測(cè)定，其動(dòng)態(tài)量化范圍在3～20 000 fmol/L，對(duì)HCV分型有一定幫助。該方法在歐洲已被許可使用，但尚未通過(guò)美國(guó)食品藥品管理局（food and drug admin?istration，F(xiàn)DA）的審核，只能應(yīng)用于科研領(lǐng)域。利用該方法檢測(cè)慢性丙肝與直接檢測(cè)HCV RNA相比，成本更加低廉、操作更加便捷。利用酶聯(lián)免疫法的HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒已在我國(guó)獲得專利并應(yīng)用于臨床。但HCV抗原檢測(cè)法的最低檢出限（lowest limit of detection，LLOD）對(duì)應(yīng)于HCV RNA為500～3 000 IU/mL，具體數(shù)值取決于病毒的基因型［13］。當(dāng)前丙肝的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是應(yīng)答指導(dǎo)治療（response?guided therapy，RGT），需要對(duì)丙肝病毒基因型進(jìn)行檢測(cè)，不同基因型的用藥量不同［14］。所以，檢測(cè)核心抗原的方法忽視了病毒基因型特異性，尚不適用于當(dāng)前的丙肝診斷與治療。我們正在進(jìn)行的研究，就是在檢測(cè)HCV核心抗原基礎(chǔ)上，同時(shí)檢測(cè)NS3、NS4抗原，由于NS3、NS4抗原在不同HCV基因型中存在特異性，故對(duì)HCV基因分型有一定的輔助作用，可對(duì)丙型肝炎進(jìn)行綜合診斷［15］。

1.2 檢測(cè)HCV抗體

HCV抗體是臨床常見(jiàn)的針對(duì)HCV感染的檢測(cè)指標(biāo)。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心（the center for disease control and prevention，CDC）2013年發(fā)布的針對(duì)診斷HCV臨床醫(yī)生及實(shí)驗(yàn)室工作人員指南中，將HCV抗體檢驗(yàn)列為對(duì)危險(xiǎn)人群的初篩手段，抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性的樣本將繼續(xù)進(jìn)行HCV RNA定性分析以明確診斷并做基因型鑒別［16?17］。常規(guī)方法是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked im?mune sorbent assay，ELISA）進(jìn)行篩查。其原理是用包被在介質(zhì)上的重組或合成的抗原來(lái)捕獲樣品中的丙肝免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），被捕獲的丙肝抗體與酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，隨后酶催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過(guò)顏色變化可判斷丙肝抗體檢測(cè)結(jié)果。該方法聯(lián)合重組免疫印跡試驗(yàn)（recombinant immunoblot assay，RIBA），可有效提高檢出率，在臨床與科研中，常作為確認(rèn)HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)。RIBA技術(shù)是首先在硝酸纖維膜條上包被HCV合成抗原（C，NS4?1，NS4?2，NS5）以及重組抗原NS3及對(duì)照蛋白，進(jìn)而將硝酸纖維膜條浸泡在稀釋的血清或血漿樣品中反應(yīng)后，加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體溫育，如樣品中含有HCV特異性抗體，則會(huì)形成“包被抗原?抗體?酶標(biāo)二抗”復(fù)合物，利用顯色液顯色，最終根據(jù)出現(xiàn)的不同條帶情況判斷結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)是檢驗(yàn)過(guò)程全程自動(dòng)化，可重復(fù)性高，成本較低。其缺點(diǎn)是HCV感染患者出現(xiàn)HCV抗體較晚，檢測(cè)窗口期長(zhǎng)，對(duì)處在窗口期內(nèi)的樣本漏檢率高，靈敏度低?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）彌補(bǔ)了ELISA方法的不足，其靈敏度高，檢測(cè)速度也較快，能縮短檢測(cè)窗口期，且較基因檢測(cè)成本低，技術(shù)要求也較低，易于普及，主要用于血源篩查及血制品安全性檢測(cè)。檢測(cè)HCV抗體的試劑盒已經(jīng)獲國(guó)家批準(zhǔn)并上市，不同種類試劑盒分別應(yīng)用膠體金法、酶聯(lián)免疫法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等不同技術(shù)。

1.3 床邊自測(cè)系統(tǒng)（point?of?care tests，POCT）

床邊自測(cè)系統(tǒng)是出于對(duì)患者的照顧而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室外檢測(cè)。它包含基于凝集反應(yīng)、免疫層析以及免疫過(guò)濾的一系列免疫學(xué)檢測(cè)。其基本原理是對(duì)患者體液內(nèi)的HCV抗體進(jìn)行檢測(cè)，解決了樣品保存的問(wèn)題，做到了現(xiàn)場(chǎng)取樣現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。該方法適用于HCV大規(guī)模篩查，并提高了沒(méi)有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室地區(qū)的HCV篩查能力。為了替代生物學(xué)檢查，需要獲得全血樣本，靜脈穿刺取血正在被改進(jìn)?？梢酝ㄟ^(guò)諸如唾液收集或指尖取血獲得樣本。血樣還可以通過(guò)濾紙收集稱為干血點(diǎn)法（dry blood method，DBS），這使得樣品可以無(wú)污染的存儲(chǔ)、運(yùn)輸以及郵寄。HCV RNA可以利用DBS法，結(jié)合經(jīng)典PCR或real?time PCR進(jìn)行量化分析，不過(guò)靈敏度會(huì)有所降低。歐洲最近批準(zhǔn)了以體液和唾液為樣本的床邊自測(cè)檢查，F(xiàn)DA還批準(zhǔn)了指尖取血和靜脈穿刺法。其中口腔樣本和血液樣本有著更高的靈敏度和特異度［18］。應(yīng)用該方法檢測(cè)HCV，對(duì)HCV病毒載量最低要求是1 000 IU/ mL［19］。目前FDA許可或批準(zhǔn)了16種抗丙肝病毒篩查測(cè)試套件。這些方法只用于篩查，確診HCV還需要補(bǔ)充其他基因、免疫檢查法［20］。雅培診斷生產(chǎn)的床旁血液監(jiān)護(hù)系統(tǒng)（Abbott i?STAT System）是一種便攜式臨床分析儀，已通過(guò)FDA認(rèn)證，通過(guò)血液樣本能對(duì)患者人類免疫缺陷病毒（human immunodefi?ciency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、HCV等疾病進(jìn)行篩查，可應(yīng)用于急診科與社區(qū)醫(yī)院［21］。

1.4 電化學(xué)技術(shù)

電化學(xué)技術(shù)是一種特殊的檢測(cè)手段，其實(shí)驗(yàn)流程是將待檢樣本與生物學(xué)傳感器結(jié)合，產(chǎn)生生物化學(xué)信號(hào)，利用電化學(xué)原理，如電流滴定法、電導(dǎo)測(cè)定法、阻抗及光譜學(xué)技術(shù)將生化信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最后利用微電子學(xué)收集、分析信號(hào)，得出結(jié)論。其中的“生物學(xué)傳感器”可以是依據(jù)免疫學(xué)原理設(shè)計(jì)的免疫學(xué)傳感器，也可以是利用依據(jù)DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的基因傳感器［22］。故該技術(shù)是一種跨學(xué)科、跨專業(yè)的綜合檢驗(yàn)手段，其設(shè)計(jì)難點(diǎn)是將生物化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的過(guò)程，目前隨著納米材料的應(yīng)用，該技術(shù)正取得快速的突破，未來(lái)將應(yīng)用于慢性丙肝患者的家庭檢測(cè)及醫(yī)院的快速診斷。

2 基因診斷

基因診斷較傳統(tǒng)的檢測(cè)手段可以更直接、更客觀的檢測(cè)病原體或病因，該手段可為疾病防治提供更準(zhǔn)確的信息，是醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域發(fā)展的方向。其窗口期短，靈敏度高，易于早期診斷。以re?al?time PCR為代表的基因診斷技術(shù)，是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的HCV感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法和確診手段。

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real?time PCR）

其試驗(yàn)原理為：反轉(zhuǎn)錄丙肝病毒RNA，合成互補(bǔ)DNA，并以它為模板做PCR檢測(cè)。不同于傳統(tǒng)PCR的是，real?time PCR通過(guò)記錄反應(yīng)中擴(kuò)增子的數(shù)量，推導(dǎo)出反應(yīng)起始階段臨床樣本中病毒基因組的數(shù)量。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物以及一個(gè)特異性熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′?3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，釋放熒光信號(hào)，被檢測(cè)裝置收集。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。用軟件來(lái)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的臨界周期，從而繪制與反應(yīng)起始基因組量的線性關(guān)系圖。從而檢測(cè)出樣本中HCV的病毒載量［23］。目前，已有2種HCV RNA檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床，分別是雅培實(shí)時(shí)HCV檢測(cè)法（abbott real?time HCV test，ART）和羅氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV檢測(cè)法（Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test，CAP/CTM）。ART檢測(cè)法擁有更高的準(zhǔn)確度，而CAP/CTM檢測(cè)法的預(yù)測(cè)值更高，故其HCV早期篩查的臨床實(shí)用性更高［24］。兩種方法的最低檢出限度基本都維持在12 IU/mL，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)PCR方法（50～100 IU/mL）［25］。real?time PCR是目前公認(rèn)的判斷丙肝感染最可靠的方法，臨床上被認(rèn)為是開(kāi)始干擾素及病毒唑治療的直接依據(jù)。與抗原篩查相比，real?time PCR技術(shù)存在的不足是RNA不易保存，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，診斷成本較高，不適用于長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HCV感染的患者。

2.2 實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（real?time transcrip?tion mediated amplification，real?time TMA）

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)在等溫條件下使用兩種酶，一種逆轉(zhuǎn)錄酶和一種T7 RNA聚合酶。這種擴(kuò)增包含單鏈RNA。病毒包膜溶解后，HCV基因組被寡核苷酸探針捕獲并綁定到磁性微粒上。擴(kuò)增涉及兩種酶的等溫自動(dòng)催化。每個(gè)新合成的RNA作為模板重新進(jìn)入TMA過(guò)程。與real?time PCR原理類似，加入特異性熒光探針，通過(guò)記錄熒光信號(hào)計(jì)算出樣品中最初的HCV含量［23］。該方法可以看做高靈敏度的real?time PCR方法，其最低檢出限度的病毒量為5～10 IU/mL，與real?timePCR均可以用來(lái)檢測(cè)1型、3型HCV病毒血癥的最小殘留值（2、4型HCV尚不能利用real?time TMA方法檢測(cè)），可用作預(yù)后判斷。但在病毒血癥的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用有待證實(shí)［24］。該方法靈敏度高，但假陽(yáng)性率隨之升高，檢驗(yàn)價(jià)格昂貴。

2.3 基因芯片技術(shù)

新近發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)在基因診斷領(lǐng)域有著重要地位，它可以將生物學(xué)中許多不連續(xù)的分析過(guò)程，移植到固相的介質(zhì)芯片上，并使其連續(xù)化和微型化。其基本原理是通過(guò)分子雜交的方法直接對(duì)已知核酸序列的病原體基因片段（傳染?。┖鸵阎蛔兾稽c(diǎn)（遺傳病、腫瘤等）的基因片段進(jìn)行檢測(cè)。目前，診斷病毒性肝炎要依次對(duì)甲、乙、丙、丁、戊等肝炎進(jìn)行篩查，過(guò)程繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力?；蛐酒夹g(shù)基于堿基互補(bǔ)的原理，對(duì)病原體核酸進(jìn)行直接檢測(cè)，將來(lái)的診斷芯片有可能同時(shí)對(duì)所有肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，具有非常大的發(fā)展前景［25］。感染性病原體診斷基因芯片就是將待測(cè)病原體的特征基因片段（靶基因）固定于玻片上制成檢測(cè)芯片，將從患者血清中抽提出病原體的RNA經(jīng)擴(kuò)增、標(biāo)記熒光后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)由掃描儀掃描，再經(jīng)計(jì)算機(jī)的分析進(jìn)行確診［26?28］。目前常用的基因芯片以HCV各基因亞型5′段非編碼區(qū)（non?coding region，NCR）設(shè)計(jì)特異性探針，與逆轉(zhuǎn)錄?巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性［29］。多種基因芯片已在我國(guó)申請(qǐng)專利，由于該方法簡(jiǎn)便快捷，主要應(yīng)用于HCV的實(shí)驗(yàn)室分型。

2.4 基因測(cè)序技術(shù)

利用基因測(cè)序技術(shù)，最經(jīng)典、最準(zhǔn)確的診斷方法為直接測(cè)序法，該方法對(duì)HCV進(jìn)行全基因組測(cè)序，直接確定病毒基因型，其他分型方法都將該方法視為參考標(biāo)準(zhǔn)，但該方法操作繁瑣、工作量大，不適宜在臨床上廣泛使用。型特異性引物PCR法，結(jié)合了基因測(cè)序技術(shù)與real?time PCR技術(shù)。該技術(shù)基于HCV病毒某部分基因序列在不同亞型間存在較高差異度，如NS5B區(qū)基因序列，首先設(shè)計(jì)引物，進(jìn)而通過(guò)real?time PCR技術(shù)對(duì)特定區(qū)段進(jìn)行定量擴(kuò)增，最后通過(guò)高通量基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，并與各型病毒標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行對(duì)比，明確病毒基因型。在此技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同引物的退火溫度不同而設(shè)計(jì)出型特異性探針退火法。該方法在同一反應(yīng)體系中加入不同種引物，利用其退火溫度不同，對(duì)不同區(qū)段基因序列進(jìn)行定量擴(kuò)增，是目前對(duì)HCV變異株進(jìn)行篩查的常用手段。以干擾素與病毒唑?yàn)榛A(chǔ)的丙型肝炎抗病毒治療，其療程與用藥量依賴于病毒的基因分型，故基因測(cè)序技術(shù)對(duì)臨床用藥及患者預(yù)后有著重要意義，是目前臨床最常用的病毒分型方法。與免疫診斷相比，其缺點(diǎn)是僅適用于HCV RNA陽(yáng)性樣本，對(duì)血清中的病毒量要求高，同時(shí)結(jié)合了re?al?time PCR及基因測(cè)序技術(shù)，其檢驗(yàn)成本高，不適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)及社區(qū)醫(yī)院。

3 臨床診斷

丙型肝炎的患者缺乏典型癥狀，急性丙型肝炎的臨床表現(xiàn)一般較輕，類似感冒，少數(shù)患者以頭痛、發(fā)熱、四肢酸痛等癥狀為主，伴或不伴有全身乏力，食欲減退，惡心、嘔吐、厭油、腹脹、肝區(qū)痛、尿色加深等癥狀。輕度慢性丙肝病情較輕，可反復(fù)出現(xiàn)乏力，頭暈，食欲有所減退，厭油、尿黃、肝區(qū)不適、睡眠不佳等癥狀，肝稍大有輕觸痛，可伴有輕度脾大。重度慢性丙肝患者有明顯或持續(xù)的肝炎癥狀，如乏力、納差、腹脹、尿黃等，伴肝病面容，肝掌，脾大。重型丙肝患者在2周內(nèi)出現(xiàn)極度乏力，嚴(yán)重消化道癥狀、出現(xiàn)神經(jīng)、精神癥狀、表現(xiàn)為嗜睡、性格改變、煩躁不安，昏迷肝性腦病等。由于各型病毒性肝炎的臨床表現(xiàn)極為相似，當(dāng)出現(xiàn)上述癥狀后，主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)各型肝炎加以鑒別，詳細(xì)詢問(wèn)患者的既往病史、生活工作環(huán)境，明確患者有無(wú)輸血史、器官移植史、靜脈吸毒史對(duì)確診有一定的輔助意義。

4 展望

HCV最大的特點(diǎn)為基因組的高度特異性，不同HCV分離株的核苷酸及氨基酸同源性有較大差異，這種基因變異與丙型肝炎易發(fā)展成慢性肝炎、HCV易形成免疫逃逸株以及疫苗研制困難有密切的關(guān)系。對(duì)HCV的診斷需要結(jié)合臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。近期發(fā)布的歐洲肝病學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南提出，以HCV抗體作為HCV感染的一線診斷指標(biāo)。對(duì)于急性丙肝患者及免疫力低下人群，將HCV RNA列入初始評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于HCV抗體陽(yáng)性的患者應(yīng)加做敏感的基因檢測(cè)。對(duì)HCV抗體陽(yáng)性但基因檢測(cè)陰性的患者應(yīng)于3個(gè)月后復(fù)查。指南推薦對(duì)抗病毒治療的患者，應(yīng)用real?time PCR進(jìn)行療效監(jiān)控［30］。受制于較高的成本，該技術(shù)在偏遠(yuǎn)地區(qū)、社區(qū)醫(yī)院以及慢性肝炎的家庭中較難開(kāi)展。相比之下，免疫診斷速度快、成本低，有著很好的臨床應(yīng)用前景。我們正在研制以核心蛋白、NS3、NS4蛋白為抗原的檢驗(yàn)試劑盒。該試劑盒利用抗原篩查技術(shù)，對(duì)患者血清中的幾種病毒抗原進(jìn)行定量篩查。該試劑盒中的NS3、NS4抗原在不同基因型中的變異較大，相較于傳統(tǒng)方法中單獨(dú)檢測(cè)HCV核心抗原，既提高了檢測(cè)的靈敏度，也對(duì)病毒的分型、對(duì)癥治療給予一定幫助。與針對(duì)HCV特異性抗體的免疫學(xué)診斷相比，其檢驗(yàn)窗口期更短，對(duì)HCV感染的早期診斷有積極意義。該試劑盒具有較高的靈敏度，預(yù)計(jì)檢出率在90％以上。該試劑盒雖不能代替基因診斷技術(shù)在HCV診斷與分型中的核心地位，但其檢驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)便、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求不高，特別適用于不發(fā)達(dá)地區(qū)及慢性丙型肝炎的長(zhǎng)期療效監(jiān)測(cè)，也適用于門(mén)急診患者的早期快速診斷。不足之處在于該技術(shù)的最低檢出限受制于免疫檢測(cè)的先天劣勢(shì)，仍高于基因診斷技術(shù)。由NS3、NS4抗原制備的單克隆抗體，在不同基因型的病毒檢測(cè)中效價(jià)不同，易漏診某些特殊變異的基因型。

［1］Hajarizadeh B，Grebely J，Dore GJ.Epidemiology and natural history of HCV infection［J］.Nat Rev Gastroen?terol Hepatol，2013，10（9）：553?562.

［2］Swiatek BJ.Is interleukin?10 gene polymorphism a pre?dictive marker in HCV infection？［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2012，23（1?2）：47?59.

［3］Aspinall EJ，Hutchinson SJ，Janjua NZ，et al.Trends in mortality after diagnosis of hepatitis C virus infec?tion：An international comparison and implications for monitoring the population impact of treatment［J］.J Hepatol，2015，62（2）：269?277.

［4］Mondelli MU，Silini E.Clinical significance of hepati?tis C virus genotypes［J］.J Hepatol，1999，31（Suppl 1）：65?70.

［5］Park Y，Lee JH，Kim BS，et al.New automated hepa?titis C virus（HCV）core antigen assay as an alternative to real?time PCR for HCV RNA quantification［J］.J Clin Microbiol，2010，48（6）：2253?2256.

［6］Hosseini Moghaddam SM，Iran?Pour E，Rotstein C，et al.Hepatitis C core Ag and its clinical applicability：po? tential advantages and disadvantages for diagnosis and follow?up？［J］.Rev Med Virol，2012，22（3）：156?165.

［7］Descamps V，Op de Beeck A，Plassart C，et al.Strong correlation between liver and serum levels of hepatitis C virus core antigen and RNA in chronically infected patients［J］.J Clin Microbiol，2012，50（2）：465?468.

［8］Moscato GA，Giannelli G，Grandi B，et al.Quantita?tive determination of hepatitis C core antigen in therapy monitoring for chronic hepatitis C［J］.Intervirology，2011，54（2）：61?65.

［9］Mederacke I，Potthoff A，Meyer?Olson D，et al.HCV core antigen testing in HIV?and HBV?coinfected pa?tients，and in HCV?infected patients on hemodialysis［J］.J Clin Virol，2012，53（2）：110?115.

［10］Miedouge M，Saune K，Kamar N，et al.Analytical evaluation of HCV core antigen and interest for HCV screening in haemodialysis patients［J］.J Clin Virol，2010，48（1）：18?21.

［11］Kadkhoda K，Smart G.HCV antigen testing for the di?agnosis of hepatitis C infection：a cost?efficient algo?rithm［J］.Clin Lab，2014，60（4）：677?680.

［12］Tillmann HL.Hepatitis C virus core antigen testing：role in diagnosis，disease monitoring and treatment［J］.World J Gastroenterol，2014，20（22）：6701?6706.

［13］Ross RS，Viazov S，Salloum S，et al.Analytical per?formance characteristics and clinical utility of a novel assay for total hepatitis C virus core antigen quantifica?tion［J］.J Clin Microbiol，2010，48（4）：1161?1168.

［14］成軍.重視慢性丙型肝炎的應(yīng)答指導(dǎo)治療［J］.中國(guó)肝臟病雜志（電子版），2008，1（2）：1?3.

［15］Aherfi S，Solas C，Motte A，et al.Hepatitis C virus NS3 protease genotyping and drug concentration deter?mination during triple therapy with telaprevir or bo?ceprevir for chronic infection with genotype 1 viruses，southeastern France［J］.J Med Virol，2014，86（11）：1868?1876.

［16］Centers for disease control and prevention.Recommen?dations for prevention and control of hepatitis C virus（HCV）infection and HCV?related chronic disease［J］. MMWR Recomm Rep，1998，47（RR?19）：1?39.

［17］Centers for disease control and prevention.Testing for HCV infection：an update of guidance for clinicians and laboratorians［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2013，62（18）：362?365.

［18］Tucker JD，Bien CH，Peeling RW.Point?of?care test?ing for sexually transmitted infections：recent advancesand implications for disease control［J］.Curr Opin In?fect Dis，2013，26（1）：73?79.

［19］Tuaillon E，Mondain AM，Meroueh F，et al.Dried blood spot for hepatitis C virus serology and molecular testing［J］.Hepatology，2010，51（3）：752?758.

［20］Liapakis A，Lim JK.Impact of rapid point?of?care screening tests for the identification of chronic hepatitis C infection［J］.Hepatology，2013，58（2）：822?826.

［21］Kisner HJ.i?STAT point?of?care blood analyzing system［J］.Clin Lab Manage Rev，1993，7（5）：454?457.

［22］Uliana CV，Riccardi CS，Yamanaka H.Diagnostic tests for hepatitis C：recent trends in electrochemical immunosensor and genosensor analysis［J］.World J Gastroenterol，2014，20（42）：15476?15491.

［23］Chevaliez S，Rodriguez C，Pawlotsky JM.New virolog?ic tools for management of chronic hepatitis B and C［J］.Gastroenterology，2012，142（6）：1303?1313.

［24］Ogawa E，F(xiàn)urusyo N，Murata M，et al.Early phase vi?ral kinetics of chronic hepatitis C patients receiving tela?previr?based triple therapy：a comparison of two real?time PCR assays［J］.Antiviral Res，2013，99（2）：119?124.

［25］Bortoletto G，Campagnolo D，Mirandola S，et al.Com? parable performance of TMA and real?time PCR in de?tecting minimal residual hepatitis C viraemia at the end of antiviral therapy［J］.J Clin Virol，2011，50（3）：217?220.

［26］Hacia JG.Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays［J］.Nat Genet，1999，21（Suppl 1）：42?47.

［27］Falus A，Varadi A，Rasko I.The DNA?chip，a new tool for medical genetics［J］.Orv Hetil，1998，139（16）：957?960.

［28］Heller RA，Schena M，Chai A，et al.Discovery and analysis of inflammatory disease?related genes using cD?NA microarrays［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（6）：2150?2155.

［29］常靜霞，張怡青，王潔，等.慢性丙型肝炎患者病毒基因分型與血清HCV RNA水平的關(guān)系探討［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（4）：321?323.

［30］American association for the study of liver diseases.Eu?ropean association for the study of the liver.Hepatic en?cephalopathy in chronic liver disease：2014 practice guideline by the European association for the study of the liver and the American association for the study of liver diseases［J］.J Hepatol，2014，61（3）：642?659.

The prospect and advantages of immunological diagnosis of hepatitis C

WANG Qiushi1,HAO Wenbo2,LUO Shuhong2★
(1.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515; 2.Institute of Antibody Engineering,School of Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou, Guangdong,China,510515)

Hepatitis C is difficult to differentiate from other types of infectious hepatitis,as there are no clinical manifestations specific to hepatitis C.The screening and diagnosis of hepatitis C normally depend on laboratory diagnoses.In recent years,with the advancements in gene and immunological technologies,many new ideas have been proffered into the diagnosis of hepatitis C.In this review,new methods for the diagnosis of hepatitis C are discussed from 3 main aspects:immunological diagnosis,gene diagnosis and clinical diagnosis. The prospects and advantages of immunological diagnostics in clinical applications will be explored further.

Hepatitis C virus;Diagnosis;Immunological;Gene

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271931）；廣東省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2012B091100158）

1.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州510515 2.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣東，廣州510515

★通訊作者：羅樹(shù)紅，E?mail：sluo815@gmail.com