高緒娜，陳玉春，趙 倩，郭婷婷，徐海燕

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

酵母培養(yǎng)物高活性菌株的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化

高緒娜*，陳玉春，趙 倩，郭婷婷，徐海燕

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

酵母培養(yǎng)物是一種集營養(yǎng)和保健為一體的飼料添加劑，在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。從土壤樣品中分離純化得到1株生物量較高的酵母菌BLNJ03，經(jīng)16S rDNA鑒定為一株釀酒酵母。采用單因素和正交試驗(yàn)確定菌株BLNJ03的最佳發(fā)酵條件為：以液體深層發(fā)酵20 h菌株作種子液，固體發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮90%、玉米面3%、豆粕7%，料水比1∶0.7，初始pH值7.0，接種量6%，30℃有氧發(fā)酵48 h后厭氧發(fā)酵96 h。液體深層發(fā)酵與固體發(fā)酵相結(jié)合的兩步兩態(tài)法，好氧發(fā)酵與厭氧發(fā)酵相繼進(jìn)行，得到高活菌數(shù)、高營養(yǎng)成分及高消化率的酵母培養(yǎng)物。

酵母培養(yǎng)物；分離；釀酒酵母；發(fā)酵；高活性

飼料酵母一般由酵母及其培養(yǎng)物構(gòu)成，而酵母培養(yǎng)物通常指固體培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵后含培養(yǎng)物和酵母菌的混合物，其營養(yǎng)豐富，含礦物質(zhì)、維生素、消化酶、促生長因子及較豐富的氨基酸等 （王秋菊，2006；王麗娟和孫滿吉，2000）。酵母及其培養(yǎng)物作為飼料添加劑，能促進(jìn)動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡，維護(hù)腸道健康，提高生產(chǎn)性能，調(diào)節(jié)免疫功能，提高機(jī)體抗病能力（廖燦青等，2015；郭伶和儲(chǔ)科軍，2014；Zhang等，2008）。隨著人們對食品安全的重視和對綠色食品的追求，酵母培養(yǎng)物因具有無毒副作用、無殘留污染、不產(chǎn)生耐藥性且可部分替代抗生素等優(yōu)點(diǎn)，在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用（譚斌，2008）。但目前酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品存在質(zhì)量參差不齊、使用效果不穩(wěn)定等問題，亟需開發(fā)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的品牌性產(chǎn)品。本文采用液體深層發(fā)酵與固體發(fā)酵相結(jié)合的兩步兩態(tài)法制備酵母培養(yǎng)物，并進(jìn)一步對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以篩選高生物量、代謝豐富的酵母菌株。這對新型酵母培養(yǎng)物產(chǎn)品的開發(fā)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 分別從平度大澤山向陽山坡的兩處葡萄架下采集土壤樣品。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：蔗糖20 g，馬鈴薯200 g，鏈霉素20mg，瓊脂粉20 g，水1000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.2.2 純化培養(yǎng)基 酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YEPD液體培養(yǎng)基）：葡萄糖4 g，蛋白胨4 g，酵母膏2 g，蒸餾水100mL，pH 4.5，115℃滅菌20min。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏2 g，磷酸二氫鉀1 g，水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.2.4 液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基 按質(zhì)量百分比計(jì)，葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，泡敵0.05%，pH 7.0。

1.2.5 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 按質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮83%，玉米面10%，豆粕7%，料水比1g∶0.7 mL，pH 7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離 采用富集培養(yǎng)法進(jìn)行酵母菌的分離。在超凈工作臺(tái)中，用滅菌藥匙稱量樣品10 g，放入盛有40mL無菌水的帶玻璃珠的錐形瓶中，30℃搖床震蕩30min，將樣品充分打散、混勻；吸取1 mL此液體加到含鏈霉素的PDA液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)24 h，此步驟重復(fù)一次；然后用接種針蘸取培養(yǎng)液在含鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基上劃線。30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～72 h，挑取形態(tài)不同的酵母菌菌落，在YEPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，并將純化好的菌株接入斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的篩選 挑選菌落生長迅速、革蘭氏染色符合酵母菌特征的純化菌株，轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)20 h，進(jìn)行菌株生物量的測定，篩選出生物量高且遺傳穩(wěn)定的菌株。

1.3.3 發(fā)酵方法 液體深層發(fā)酵方法：（1）采用5000mL三角瓶，培養(yǎng)基裝量1000mL，121℃滅菌30min，冷卻后接種，在30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)20 h，即為一級(jí)種子菌液。（2）50 L種子罐，培養(yǎng)基裝量30 L；實(shí)消溫度121℃，時(shí)間30min；待培養(yǎng)基溫度降為30℃時(shí)接種一級(jí)種子菌液，培養(yǎng)溫度28～30℃，罐壓0.05 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速80 r/min，培養(yǎng)16 h即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)。（3）500 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為350 L；實(shí)消溫度121℃，時(shí)間30min；待培養(yǎng)基溫度降為30℃時(shí)接種，培養(yǎng)溫度28～30℃，罐壓0.05MPa，20 h放罐。

固體發(fā)酵培養(yǎng)方法：將液體深層發(fā)酵得到的菌液作為種子液，按4%～6%的接種量接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為28～30℃，有氧發(fā)酵時(shí)間為36～60 h，厭氧發(fā)酵時(shí)間為72～96 h。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 菌株生物量的測定 將菌株發(fā)酵后得到的發(fā)酵液3500 g離心10 min，收集菌體，并以0.9%生理鹽水洗滌3次，去上清收集菌體，冷凍干燥后稱重。以100mL發(fā)酵液得到的菌粉重量為菌株生物量，以g/100mL表示。

1.3.4.2 活菌數(shù)的測定 準(zhǔn)確稱取1 g樣品，裝入盛有100mL、0.90%滅菌生理鹽水的錐形瓶內(nèi)，在搖床上振蕩30min，制成1∶100的樣品溶液，將此溶液作梯度稀釋后，分別吸取1.0mL稀釋菌懸液放入無菌平板中，加入適量固體培養(yǎng)基，充分混勻。每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)，室溫下靜置5～10min后，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，選取30～300個(gè)菌落之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4.3 酵母培養(yǎng)物營養(yǎng)成分的檢測 將發(fā)酵得到酵母培養(yǎng)物低溫烘干、粉碎，進(jìn)行營養(yǎng)成分的檢測。粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法（GB/T5009.5），粗纖維采用過濾法（GB/T6364）、粗脂肪采用索氏抽提法（GB/T5009.6），以離子色譜法測定氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸等營養(yǎng)成分含量，并測定蛋白質(zhì)消化率（GB/T17811）。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化方法 采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.3.6 菌株的鑒定 鑒定方法：菌種鑒定采用chromosome XIIsequence的PCR鑒定法。酵母菌chromosome XIIsequence基因片段擴(kuò)增的引物序列為 CXS1：5’-CACAGAAATCTCTCACCG-3’，CXS2：5’-TTATGATATGCTTAAGTTC-3’，序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：dNTP Mixture 4μL，5×Prime STAR Buffer 10μL，上下游引物各0.6μL，基因組模板0.8μL，Prime STAR HSDNA Polymerase 0.6μL，無菌去離子水33.4μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃5 min；94℃1 min，52℃15 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果登陸Genbank blast在線對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選 由表1可知，不同菌株的生物量有一定差別，生物量較大的菌株編號(hào)為2、3、10號(hào)菌株，分別命名為BLNJ02、BLNJ03、BLNJ10。將這3株酵母菌分別傳接5代，并分別進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，再測定其生物量。由表2可知，3株酵母菌生物量穩(wěn)定，表明篩選到的3株酵母菌均具有良好的遺傳穩(wěn)定性，且BLNJ03菌株的生物量最高，故選擇BLNJ03菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化及酵母培養(yǎng)物營養(yǎng)成分的檢測。

表1 高生物量酵母菌株篩選結(jié)果g/100mL

表2 酵母菌遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果g/100mL

2.2 菌株BLNJ03液體深層發(fā)酵 發(fā)酵期間2 h取樣一次，鏡檢并計(jì)酵母活菌數(shù)。BLNJ03菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的生長曲線如圖1所示。

圖1 BLNJ03菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的生長曲線

由圖1可知，BLNJ03菌株在18 h左右活菌數(shù)達(dá)到最大，約24億cfu/mL，之后穩(wěn)定。因此，確定BLNJ03菌株發(fā)酵罐培養(yǎng)18～20 h放罐，作為液體種子用于下一步的固體發(fā)酵。

2.3 菌株BLNJ03固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 接種量對固體發(fā)酵的影響 接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%（體積分?jǐn)?shù)），30℃培養(yǎng)48 h，室溫下晾干，測定活菌數(shù)及絕干活菌數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖2 接種量對菌株BLNJ03固體發(fā)酵的影響

由圖2可知，接種量在2%～10%時(shí)，菌株發(fā)酵后活菌數(shù)差異不大，但接種量為6%時(shí)絕干活菌數(shù)最高。因此，菌株BLNJ03固體發(fā)酵的接種量確定為6%。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH對固體發(fā)酵的影響 將酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，121℃滅菌30 min，接種后30℃培養(yǎng)48 h，測定活菌數(shù)，結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)基初始pH對菌株BLNJ03固體發(fā)酵的影響

由圖3可知，培養(yǎng)基初始pH對菌株發(fā)酵活菌數(shù)影響很大，初始pH為7.0時(shí)活菌數(shù)最高，為pH 5.0時(shí)活菌數(shù)的1.9倍。因此，菌株BLNJ03固體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH確定為7.0。

2.3.3 豆粕含量對固體發(fā)酵的影響 在酵母菌固體發(fā)酵中，豆粕是非常重要的氮源，其含量的高低與酵母培養(yǎng)物的粗蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)。配制不同豆粕含量的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃有氧發(fā)酵48 h，測定培養(yǎng)物中活菌數(shù)及粗蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖4。

圖4 豆粕含量對菌株BLNJ03固體發(fā)酵的影響

由圖4可知，酵母培養(yǎng)物的粗蛋白質(zhì)含量隨豆粕含量的提高而上升，但活菌數(shù)在豆粕含量達(dá)20%之前變化不大，豆粕含量超過20%后活菌數(shù)迅速下降。分析可能的原因?yàn)?，隨豆粕含量增大，培養(yǎng)基黏度增大，通氣量下降，導(dǎo)致酵母菌生長緩慢。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)、成本等因素，選擇7%為最佳豆粕添加量。

2.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 將固體培養(yǎng)基中麩皮、玉米面、豆粕分別設(shè)置不同水平，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表3。

表3 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

由表3可知，各成分對菌株BLNJ03培養(yǎng)物中活菌數(shù)的影響順序?yàn)椋河衩酌妫钧熎ぃ径蛊?，極差分析的最優(yōu)組合為A2B2C3，即麩皮90%、玉米面3%、豆粕7%。

2.3.5 料水比對固體發(fā)酵活菌數(shù)的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基料水比分別調(diào)為1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶ 0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1（g∶mL），500 mL三角瓶裝量20 g，接種量為6%，30℃培養(yǎng)48 h，晾干，測定培養(yǎng)物中活菌數(shù)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，過高或過低的料水比均不利于酵母菌的生長，料水比為1∶0.5～1∶0.7時(shí)培養(yǎng)物的活菌數(shù)較高。因此，建議生產(chǎn)中將料水比定為1∶0.7。

圖5 料水比對菌株BLNJ03固體發(fā)酵的影響

2.3.6 需氧發(fā)酵時(shí)間對活菌數(shù)的影響 將菌株BLNJ03種子液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，堆積進(jìn)行好氧發(fā)酵，每12 h取樣1次，測定培養(yǎng)物中活菌數(shù)，結(jié)果見圖6。

圖6 需氧發(fā)酵時(shí)間對菌株BLNJ03固體發(fā)酵的影響

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，培養(yǎng)物中酵母活菌數(shù)逐漸增加，到48 h活菌數(shù)達(dá)到最高，為7.4×108cfu/g。之后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定。因此，菌株BLNJ03最優(yōu)需氧發(fā)酵時(shí)間確定為48 h。

2.3.7 厭氧發(fā)酵時(shí)間對營養(yǎng)成分及消化率的影響將菌株BLNJ03種子液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，有氧發(fā)酵48 h后壓實(shí)密封進(jìn)行厭氧發(fā)酵，每24 h取樣1次，測定培養(yǎng)物中氨基酸、核苷酸含量及消化率等，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨厭氧發(fā)酵時(shí)間延長，酵母培養(yǎng)物中氨基酸、核苷酸含量及消化率均逐漸升高，到96 h達(dá)到最高值，分別為11.33%、28.31 mg/g和89.05%。綜合考慮生產(chǎn)成本及發(fā)酵過程延長易污染霉菌等因素，最佳厭氧發(fā)酵時(shí)間確定為96 h。

圖7 厭氧發(fā)酵時(shí)間對菌株BLNJ03固體發(fā)酵的影響

綜上，優(yōu)化后菌株BLNJ03酵母培養(yǎng)物培養(yǎng)條件為：液體深層發(fā)酵20 h后放罐做種子液，固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮90%、玉米面3%、豆粕7%、初始pH值7.0、料水比1∶0.7、接種量6%、有氧發(fā)酵48 h后厭氧發(fā)酵96 h。

2.4 酵母培養(yǎng)物營養(yǎng)成分的檢測 將酵母BLNJ03、產(chǎn)朊假絲酵母，分別按相同培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝進(jìn)行固體發(fā)酵，結(jié)束后分別將酵母培養(yǎng)物低溫烘干、粉碎。并購買市場同類釀酒酵母固體培養(yǎng)物產(chǎn)品，測定其活菌數(shù)、營養(yǎng)成分含量及蛋白質(zhì)消化率，結(jié)果見表4。

表4 酵母固體培養(yǎng)物活菌數(shù)、營養(yǎng)成分含量及蛋白質(zhì)消化率比較

由表4可知，酵母BLNJ03固體培養(yǎng)物與產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)物、市售釀酒酵母培養(yǎng)物相比，蛋白質(zhì)含量較高，此現(xiàn)象可能與菌體蛋白有關(guān)。3種培養(yǎng)物的粗纖維、粗脂肪含量相差不大。酵母BLNJ03培養(yǎng)物的氨基酸含量比市售釀酒酵母培養(yǎng)物、產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)物高30%左右，有機(jī)酸含量是市售釀酒酵母培養(yǎng)物、產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)物的1.5～2倍。這些表明，酵母BLNJ03菌種更加優(yōu)良，在固體發(fā)酵代謝產(chǎn)物方面更具有優(yōu)勢。

2.5 菌株BLNJ03的鑒定

2.5.1 菌落及菌體形態(tài) 該菌株在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h，其菌落呈乳白色，表面光滑濕潤，有光澤或無光澤，邊緣整齊或菌絲狀，顯微鏡下觀察菌體呈圓形或橢圓形。該菌株以多邊出芽方式進(jìn)行無性繁殖，革蘭氏染色呈陽性。

2.5.2 16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析 圖8為該菌株的PCR產(chǎn)物電泳圖，條帶在1000 bp處，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖8 菌株BLNJ03擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

將菌株BLNJ03的16S rDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果顯示菌株BLNJ03 與 Saccharomyces cerevisiae的序列同源性達(dá)到100%。鑒定該菌株屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

從Genebank中調(diào)取并下載與菌株BLNJ03同源性較高的和該屬內(nèi)其他相關(guān)菌株的16S rDNA，利用MEGA5.2軟件的Neighboring-joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9）。

圖9 菌株BLNJ03與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

3 小結(jié)

從土壤樣品中分離純化得到1株用于固體發(fā)酵的釀酒酵母BLNJ03，該菌株具有高生物量、傳代穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。通過單因素和正交試驗(yàn)對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定菌株BLNJ03最優(yōu)培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件為：液體深層發(fā)酵20 h后放罐作種子液，固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮90%、玉米面3%、豆粕7%、初始pH值7.0、料水比1∶0.7、接種量6%，有氧發(fā)酵48 h后厭氧發(fā)酵96 h，得到高活菌數(shù)、高營養(yǎng)成分及高消化率的酵母培養(yǎng)物。通過16S rDNA鑒定，菌株BLNJ03為一株釀酒酵母。

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Yeast culture is a kind of feed additive，which combines nutrition and health care，and is widely used in animal production.A yeast strain BLNJ03 with high biomasswas isolated from soil samples.BLNJ03 was identified as Saccharomyces cerevisiae by its cultural characteristics，morphological characteristics and 16S rDNA sequence.The optimal fermentationmedium composition by single factor and orthogonal test showed as follows：the strain submerged fermentation 20 h was used as seed liquid；solid fermentation medium was wheat bran 90%，corn flour 3%，soybean meal 7%，and ratio ofmaterial to water 1∶0.7.The better fermentation conditions were as follows：initial pH 7.0，inoculation amount 6%，temperature 30℃，aerobic fermentation of 48 h and anaerobic fermentation 96 h then.The two-step two-statemethod for the combination of liquid submerged fermentation and solid fermentation，aerobic fermentation and anaerobic fermentation were carried out successively.Finally，the yeast culture with high viable count，high nutrient composition and high digestibility was obtained.

yeast culture；isolation；Saccharomyces cerevisiae；fermentation；high activities

S816.7

A

1004-3314（2017）01-0013-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170103

*通訊作者