董靜文+黃青

[摘要]目的探究MiRNA一351在小鼠卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用。方法選取60只雌性白鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，分別于出生第5、7、11、14天和第20天處死（每次處死12只），獲取卵巢后經(jīng)相應(yīng)處理并采取RT-PCR測(cè)定不同時(shí)刻MiRNA-351表達(dá)情況，并分析該基因表達(dá)在小鼠卵泡發(fā)育中調(diào)控作用。結(jié)果不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞凋亡水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；和Mimics-351組增殖效能相比較，Inhibitor-351水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論MiRNA-351在小鼠卵泡發(fā)育各個(gè)過(guò)程中可能均有參與，且對(duì)增殖和凋亡水平均有調(diào)控作用，值得進(jìn)一步深入探究。

[關(guān)鍵詞]MiRNA-351；小鼠；卵泡發(fā)育；調(diào)控作用

雌性哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程十分復(fù)雜，并且呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)性周期變化。在卵巢生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟、受精以及著床等均是維持正常妊娠必不可少的過(guò)程，而卵泡是卵巢生殖功能最為重要的部分，承擔(dān)著生命繁衍的重要使命。近年來(lái)隨著對(duì)人類生殖功能研究不斷深入，人們對(duì)微小RNA在卵泡發(fā)育過(guò)程中作用認(rèn)識(shí)也不斷深入。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，MiRNA-351作為一種重要的調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生理過(guò)程中均起著重要參與作用。為進(jìn)一步探究MiRNA-351在卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用，本研究特以小鼠模型為對(duì)象開(kāi)展實(shí)驗(yàn)探究，旨在為卵泡發(fā)育機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取60只雌性小白鼠作為研究對(duì)象，均購(gòu)自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，品系為C57 black 6，批號(hào)為000659。室溫條件下，12h光照、12h黑暗下飼養(yǎng)，自由采食和飲水，并嚴(yán)格控制溫度、濕度、光照條件。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）健康雌性白鼠；（2）經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未足月分娩幼鼠；（2）卵巢先天畸形，或發(fā)育異常。

1.2方法

1.2.1所有幼鼠均注射PMSG和HCG，劑量均為10IU，并于出生后第5、7、11、14天和第20天處死（每次處死12只），在顯微鏡下分離出小腔前卵泡（直徑100～130μm），大腔前卵泡（直徑200～280μm），有腔卵泡（直徑450～550μm）和成熟卵泡（直徑500～600μm），各15只。

儀器：切片機(jī)（德國(guó)Leica RM2135型）；移液器（美國(guó)Thermo Finnpipette型）；顯微鏡（日本Nikon 80i型）；微波爐（中國(guó)GalanzP7021TP-6型）；恒溫箱（中國(guó)福馬GHX-9270B-1型）；恒溫冰箱（中國(guó)榮事達(dá)BCD-245F）。

1.2.2主要試劑和設(shè)備（1）試劑：異丙醇、無(wú)水乙醇、β-強(qiáng)基乙醇、氯仿、氯化鉀、磷酸氫二鈉等均從我院實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)??；a-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗、胰酶等均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司、mRNA分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；（2）細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)康寧公司，恒溫水浴鍋（杭州朗越儀器HH-501型）、酶標(biāo)儀（北京普朗新9602A型）、高壓滅菌鍋（濟(jì)南展康BKQP-75L型）、工作臺(tái)由我院實(shí)驗(yàn)室提供、離心機(jī)（德國(guó)HERML Eppendorf 5418型）、電泳儀（美國(guó)Bio-rad 164-5070型）、超低溫冰箱（中國(guó)榮事達(dá)BCD-245F）、培養(yǎng)箱（中國(guó)福馬GHX-9270B-1型）、熒光顯微鏡（日本Nikon 80i型）等；（3）緩沖液配置：PBS、細(xì)胞培養(yǎng)液、卵泡成熟培養(yǎng)液以及卵泡分離液等均參照《現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù)》中相關(guān)方法配置。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方法參照《現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù)》依次行引物設(shè)計(jì)、卵泡MiRNA提取、顆粒細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)、顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染MiRNA、顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平檢測(cè)等，（1）引物設(shè)計(jì)（由大連寶生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成）；（2）卵泡MiRNA提?。菏紫刃袠悠诽幚?，然后采用PBS緩沖液行裂解處理，將已反轉(zhuǎn)錄好的模板行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃條件下預(yù)變性（時(shí)間為5min）、95℃條件下變性（時(shí)間為10s），60℃條件下退火（時(shí)間為30s），共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后持續(xù)緩慢升溫至95℃，自然冷卻。結(jié)果分析：利用擴(kuò)增倍數(shù)公式，重復(fù)三次計(jì)算樣品中MiRNA-351表達(dá)量；（3）顆粒細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)：使用胰酶、培養(yǎng)液等進(jìn)行顆粒細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)和傳代；（4）顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染MiRNA：轉(zhuǎn)染前應(yīng)首先行接種處理，然后將細(xì)胞置于培養(yǎng)基孔中，搖勻后在培養(yǎng)箱中37℃條件下孵育，注意需要每隔4～6h更換一次培養(yǎng)基；（5）顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平檢測(cè)：分別采用流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀對(duì)上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行凋亡和增殖水平檢測(cè)，檢測(cè)前需要將顆粒細(xì)胞進(jìn)行PBS緩沖液沖洗，離心分離。

1.3觀察指標(biāo)

觀察不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)水平，共分為小腔前卵泡、大腔前卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡等；對(duì)比MiRNA-315對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平的影響。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0國(guó)際專用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，表達(dá)水平、增殖效能等計(jì)量資料均用（x±s）的形式描述，多樣本比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)

不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中以大腔前卵泡MiRNA-315表達(dá)水平最高，小腔前卵泡、有腔卵泡次之、成熟卵泡最低，詳情見(jiàn)表1。

2.2MiRNA-315對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡水平的影響

不同卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞凋亡水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中有腔卵泡凋亡水平最高、小腔前和成熟卵泡次之、大腔前卵泡最低，詳情見(jiàn)表2。

2.3MiRNA-315對(duì)顆粒細(xì)胞增殖水平的影響

和Mimics-351組增殖效能相比較，Inhibitor-351水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳情見(jiàn)表3。

3討論

雌性哺乳動(dòng)物剛出生時(shí)卵巢內(nèi)便存在有大量的卵泡，此類原始卵泡將會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和卵泡池的建立逐漸開(kāi)始啟動(dòng)生長(zhǎng)、凋亡等一系列生理過(guò)程。原始卵泡同時(shí)也會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和年齡的增長(zhǎng)不斷消亡耗竭，只有極少數(shù)能夠發(fā)育至成熟。而另外巨大部分卵泡由于GCs的凋亡在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)閉鎖。GCs凋亡在卵泡發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用已在小鼠模型中得到驗(yàn)證，并且隨著研究不斷深入，相關(guān)抗凋亡因子和促凋亡因子及其作用也逐漸被挖掘明確。其中MiRNAs在不同出生天數(shù)，即不同卵巢發(fā)育程度時(shí)間表達(dá)譜中顯示顯著差異，并且在其它動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)。MiRNA-351作為其中較為重要的一份子，在小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程中具有顯著作用。

MiRNA-351具有多重功能，在前脂肪細(xì)胞及干細(xì)胞增殖、分化、凋亡及激素分泌調(diào)節(jié)中均具有顯著作用。該因子水平過(guò)度表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞局部形態(tài)學(xué)方面變化，并且在卵巢卵泡細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控作用中均有參與。據(jù)國(guó)外相關(guān)研究資料表明，將小鼠中的MiRNA-351基因敲除，將會(huì)使得卵泡細(xì)胞增殖受抑，并且在分化向凋亡轉(zhuǎn)換進(jìn)程將會(huì)被明顯縮短，且在MiRNA過(guò)表達(dá)小鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)卵泡細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程也同樣發(fā)生異常，在凋亡和增殖分化過(guò)程中也同樣涉及MiRNA表達(dá)及調(diào)控作用。此外，MiRNA-351表達(dá)由于在小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程中作用不同，故而其表達(dá)水平和調(diào)控機(jī)制也不相同，在特定階段可能對(duì)復(fù)雜基因均有調(diào)控作用，從而影響其卵泡凋亡和增殖水平。MiRNA-351在不同生理發(fā)育過(guò)程和特定時(shí)間內(nèi)才會(huì)表達(dá)，并參與復(fù)雜基因調(diào)控機(jī)制，從而促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。Mimics-351屬于一種模擬酶，可通過(guò)抑制相關(guān)基因表達(dá)對(duì)卵泡細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)向調(diào)控作用，同時(shí)還可抑制其增殖和生長(zhǎng)，推測(cè)該因子可能通過(guò)降解相關(guān)基因mRNA以調(diào)控卵泡細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)；而Inhibitor-351為MiRNA-351基因受體，主要通過(guò)翻譯抑制和蛋白質(zhì)調(diào)控途徑發(fā)揮作用，從而控制卵泡發(fā)育和閉鎖平衡。當(dāng)前，關(guān)于MiRNA-351對(duì)小鼠卵泡發(fā)育中調(diào)控作用機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不夠深入，但是對(duì)于Mimics-351和Inhibitor-351二者在卵泡發(fā)育中異常表達(dá)已得到一致肯定，將為雌性動(dòng)物卵巢中卵泡生長(zhǎng)機(jī)制發(fā)育和病理改變研究提供奠定基石。

本研究結(jié)果中，不同卵泡發(fā)育程度MiRNA-315表達(dá)水平存在顯著差異，且MiRNA-315對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平的影響也顯而易見(jiàn)，推測(cè)該因子表達(dá)水平和小鼠卵泡發(fā)育程度、細(xì)胞增殖和凋亡作用及機(jī)制均有顯著調(diào)控作用。綜上，MiRNA-315可能參與小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程內(nèi)在調(diào)控，在一系列生理改變過(guò)程中均有明顯作用。但是本研究仍存在不足：目前Mimics-351和Inhibitor-351具體作用機(jī)制尚不明確，且MiRNA-315和卵巢卵泡細(xì)胞病理改變臨床關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究探索，而隨著分子生物學(xué)發(fā)展不斷深入，上述問(wèn)題將會(huì)成為今后研究重點(diǎn)和發(fā)展方向。