楊愛(ài)軍，于春娜，牛煥付，王雪楠，劉樹(shù)真，魏澤鋒，郝翠芳

(1.青島大學(xué)，青島 266071； 2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，濟(jì)寧 272029;3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014)

·實(shí)驗(yàn)研究·

不同融合參數(shù)對(duì)小鼠圓形精子細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合胚胎發(fā)育的影響

楊愛(ài)軍1#，于春娜2#，牛煥付2，王雪楠2，劉樹(shù)真3，魏澤鋒2，郝翠芳1*

(1.青島大學(xué)，青島 266071； 2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，濟(jì)寧 272029;3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014)

目的 利用手工克隆 (handmade cloning， HMC) 技術(shù)對(duì)小鼠圓形精子細(xì)胞與去透明帶卵母細(xì)胞進(jìn)行電融合，以研究電融合參數(shù)對(duì)融合胚胎發(fā)育潛能的影響。 方法 選取549枚卵母細(xì)胞與圓形精子細(xì)胞融合，根據(jù)電融合參數(shù)分為三組：A組(n=186)采用電場(chǎng)強(qiáng)度60 V/mm、脈寬30 μs、脈沖次數(shù)為 2次的直流電脈沖；B組(n=188)采用電場(chǎng)強(qiáng)度80 V/mm、脈寬20 μs、脈沖次數(shù)為2次的直流電脈沖；C組(n=175)采用電場(chǎng)強(qiáng)度100 V/mm、脈寬10 μs、脈沖次數(shù)為2次的直流電脈沖。觀察記錄不同電融合參數(shù)下圓形精子細(xì)胞與無(wú)透明帶卵母細(xì)胞的融合率、融合胚胎卵裂率以及囊胚形成率。 結(jié)果 (1)A組圓形精子細(xì)胞與去透明帶卵母細(xì)胞的平均融合率為(84.87±3.84)%，與其他兩組[(74.93±5.46)%、(73.60±5.48)%]相比平均融合率顯著升高(P<0.05)；(2)A組融合胚胎的平均卵裂率為(77.37±3.97)%，與B組、C組融合胚胎的卵裂率[(67.74±7.32)%、(66.17±9.87)%]相比顯著升高(P<0.05)；(3)A組的平均囊胚形成率為(41.28±6.50)%，顯著高于C組[(31.03±6.09)%](P<0.05)。 結(jié)論 A組采用電場(chǎng)強(qiáng)度60 V/mm、脈寬30 μs、脈沖次數(shù)為2的直流電脈沖是圓形精子細(xì)胞與去透明帶卵母細(xì)胞融合的最佳方案，有利于提高胚胎的發(fā)育潛能。

電融合參數(shù); 圓形精子細(xì)胞; 去透明帶卵母細(xì)胞

(JReprodMed2017，26(1)：53-58)

手工克隆(HMC)技術(shù)是一種新的核移植技術(shù)，與SCNT技術(shù)相比，無(wú)需借助價(jià)格昂貴的顯微操作儀器，簡(jiǎn)化了核移植程序，降低了醫(yī)療費(fèi)用。Selokar等[4]利用HMC技術(shù)獲得牛-水牛、水牛-水牛、山羊-水牛、大鼠-水牛胚胎，并且利用HMC技術(shù)已成功獲得了牛[5]、馬[6]以及豬[7]等幾種家畜的克隆后代。由于去除了卵母細(xì)胞最外層的透明帶，因此卵母細(xì)胞與圓形精子細(xì)胞的融合無(wú)需再借助于顯微操作儀器， HMC技術(shù)方法簡(jiǎn)單，且能降低患者的治療費(fèi)用。在HMC技術(shù)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是圓形精子細(xì)胞與去透明帶卵母細(xì)胞有效的電融合，可以通過(guò)選擇電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度兩個(gè)重要的電融合參數(shù)來(lái)提高融合率[8]。本研究旨在尋求小鼠圓形精子細(xì)胞與去透明帶卵母細(xì)胞融合的最適電壓強(qiáng)度和脈沖寬度，以獲得較高的融合率和囊胚形成率，提高融合胚胎的發(fā)育潛能，同時(shí)為男性原發(fā)性無(wú)精子癥或非梗阻性無(wú)精子癥患者的治療提供參考方法。

材料與方法

一、材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明白雌性及雄性小鼠(清潔級(jí))均購(gòu)買于山東大學(xué)新藥評(píng)價(jià)中心(SCXK(魯)20130009)，雌性小鼠4～6周齡，雄性小鼠10周齡。飼養(yǎng)條件：溫度為20～22℃，濕度為40%～60%，光照周期(白天光照12 h，夜間黑暗12 h)。自由飲水取食，飼料為小鼠生長(zhǎng)飼料，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

2. 儀器和試劑：電融合儀CF-150B(BLS，匈牙利)；體視顯微鏡K-400及倒置顯微鏡AE31(Motic，美國(guó))；培養(yǎng)箱MCO-15AC(SANYO，日本)；胚胎聚集針DN-10(BLS，匈牙利)；自制口吸管；孕馬血清促性腺激素(PMSG)和HCG(寧波三生藥業(yè))；KSOM培養(yǎng)液(Millipore，美國(guó))；牛血清白蛋白(BSA)(Roche，美國(guó))；其他試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

3. 溶液配制：(1)CZB培養(yǎng)液：稱取NaCl 477.0 mg，KCl 36.0 mg，KH2PO416.0 mg，MgSO4·7H2O 29.0 mg，NaHCO3211.0 mg，CaCl2·2H2O 25.0 mg，60%乳酸鈉584.0 mg，丙酮酸鈉3.0 mg，EDTA·Na24.1 mg，L-谷氨酰胺14.6 mg，青霉素6.0 mg，鏈霉素5.0 mg，葡萄糖110.0 mg，BSA 500 mg溶于100 ml三蒸水中，過(guò)濾除菌分裝，-20℃冰箱內(nèi)保存；(2)H-CZB：稱取238.31 mg Hepes溶于100 mL CZB中；(3)酸性CZB溶液(pH 2.5)：將10 μl的10 mol/L HCl加入1 ml CZB中；(4)SrCl2(100 mmol/L)：2.666 g SrCl2·6H2O溶于98 ml三蒸水中。激活處理前用含L-谷氨酰胺CB的無(wú)鈣CZB稀釋得到濃度為10 mmol/L的工作液；(5)電融合液：甘露醇2 732.7 mg，MgSO4·7H2O 1.232 mg，CaCI2·2H2O 0.368 mg，BSA 50 mg，溶于50 ml三蒸水中過(guò)濾除菌分裝，保存于4℃冰箱內(nèi)；(6)植物凝集素(PHA)溶液(200 μg/ml)：將1 mg PHA粉末溶于5 ml H-CZB，每個(gè)EP管分裝200 μl，-20℃保存。

二、研究方法

1. WOW培養(yǎng)皿的制作：用無(wú)菌的胚胎聚集針在60 mm培養(yǎng)皿上壓制小凹，每排5個(gè)小凹相鄰，用預(yù)平衡的KSOM培養(yǎng)液覆蓋小凹，覆蓋石蠟油，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜平衡。

2.圓形精子細(xì)胞準(zhǔn)備：圓形精子細(xì)胞的準(zhǔn)備參照Ogura等[9]的方法：采用頸椎脫臼法處死昆明白雄鼠，取出一側(cè)睪丸將被膜剝離，用兩個(gè)1 ml無(wú)菌注射器將曲細(xì)精管劃碎，置Hepes-CZB中離心2次 (1 000 r/min， 5 min/次)， 最后用生理鹽水重懸沉淀物。在顯微鏡下可看到圓形精子細(xì)胞中央有明顯的球形區(qū)(染色質(zhì)團(tuán)構(gòu)成的輪廓)，體積比其它生精細(xì)胞小(直徑約為10 μm)，因此在顯微鏡下可根據(jù)其大小與其他生精細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

每一個(gè)心理學(xué)派的心理隱喻都存在著巨大的差異，這些差異使得心理治療模式得到不斷的改善。從第一個(gè)心理學(xué)治療模式——經(jīng)典精神分析模式開(kāi)始，就開(kāi)啟了人們對(duì)于心理治療的探究里程，直至目前的后現(xiàn)代心理治療，中間經(jīng)歷了不斷的變革、更改，這些心理治療模式的差異也暗示了人類社會(huì)地位、生活環(huán)境在不斷改變。為了幫助人們對(duì)心理治療理論及方法具有更深層次的理解，提高對(duì)心理治療的關(guān)注程度，筆者對(duì)心理隱喻的變遷進(jìn)行調(diào)查分析，總結(jié)了心理學(xué)發(fā)展研究的特點(diǎn)，并對(duì)其精華進(jìn)行分析總結(jié)，以便運(yùn)用至我國(guó)心理治療中。

3.卵母細(xì)胞激活：選擇發(fā)情間期的昆明白雌鼠每只腹腔注射10 U的PMSG，48 h后每只注射10 U的HCG，于13～14 h后用頸椎脫臼法處死小鼠，在無(wú)菌條件下取出輸卵管壺腹部，放入H-CZB中，用無(wú)菌注射針刺破輸卵管壺腹部，將取出的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體放入0.1%透明質(zhì)酸酶中消化1 min，以便脫去顆粒細(xì)胞，共取得549枚卵母細(xì)胞，然后將卵母細(xì)胞在H-CZB溶液中清洗5次，移入融合液中放置1～2 min。每5個(gè)卵母細(xì)胞一組，施以120 V/mm，10 μs×1的直流電脈沖激活卵母細(xì)胞，將激活后的卵母細(xì)胞在H-CZB溶液中清洗5次后，移入CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h。

4.卵母細(xì)胞透明帶去除：激活的卵母細(xì)胞在CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h后，移入酸性H-CZB中，觀察到卵母細(xì)胞透明帶去除時(shí)，將卵母細(xì)胞移到H-CZB溶液中清洗5次。

5.電融合及分組：將去透明帶卵母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞加入到PHA中，用玻璃針將卵母細(xì)胞推到圓形精子細(xì)胞上，粘附形成卵母細(xì)胞-圓形精子細(xì)胞對(duì)，將卵母細(xì)胞-圓形精子細(xì)胞對(duì)在融合液中清洗3次，然后在融合液中平衡1～2 min，把圓形精子細(xì)胞-卵母細(xì)胞對(duì)放入充滿融合液的融合槽中，使兩者的切面與電流方向垂直，根據(jù)融合參數(shù)不同，分為A、B、C三組：施加電場(chǎng)強(qiáng)度分別為60 V/mm、80 V/mm、100 V/mm，脈沖寬度分別為30 μs、20 μs、10 μs，脈沖次數(shù)為2的直流電脈沖。每組試驗(yàn)重復(fù)7次，計(jì)算7次實(shí)驗(yàn)的平均值。

每次試驗(yàn)頸椎脫臼法處死2～3只昆明白小鼠，每次獲卵數(shù)是20枚或者30枚左右，A、B、C三組總獲卵數(shù)分別為186枚、188枚和175枚。融合后的卵放入KSOM中洗3遍，然后移入覆蓋KSOM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，15～20 min后觀察融合情況，統(tǒng)計(jì)融合率。

6.融合胚胎的激活：將融合后的胚胎移入10 mmol/L SrCl2內(nèi)激活3 h，將激活后的融合胚胎移入覆蓋石蠟油的KSOM小凹培養(yǎng)皿(圖1)中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

7.觀察指標(biāo)：每24 h觀察胚胎的發(fā)育情況，詳細(xì)記錄卵裂胚胎的數(shù)目和形成囊胚的數(shù)目，統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚形成率。

圖1 WOW培養(yǎng)皿培養(yǎng)的融合胚胎(100×)

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、不同融合參數(shù)下各組的融合胚胎融合率、卵裂率及囊胚形成率比較

A、B、C三組試驗(yàn)共獲取549枚卵母細(xì)胞。其中，A組(n=186)在電場(chǎng)強(qiáng)度為60 V/mm、脈沖寬度為30 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，有158枚卵母細(xì)胞與圓形精子細(xì)胞發(fā)生融合、122枚融合胚胎發(fā)生卵裂、65枚胚胎發(fā)育至囊胚；B組(n=188)在電場(chǎng)強(qiáng)度為80 V/mm、脈沖寬度為20 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，有142枚卵母細(xì)胞與圓形精子細(xì)胞發(fā)生融合、98枚融合胚胎發(fā)生卵裂、60枚胚胎發(fā)育至囊胚；C組(n=175)在電場(chǎng)強(qiáng)度為100 V/mm、脈沖寬度為10 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，有130枚卵母細(xì)胞與圓形精子細(xì)胞發(fā)生融合、87枚融合胚胎發(fā)生卵裂、42枚胚胎發(fā)育至囊胚；A組的平均胚胎融合率、卵裂率均高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組的囊胚形成率顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 不同參數(shù)下各組融合胚胎融合率、卵裂率及囊胚形成率比較(%)

組別作用卵數(shù)融合率卵裂率囊胚形成率A組1868487±3847737±3974128±650B組1887493±546?6774±732?3475±524C組1757360±548?6617±987?3103±609?

注：數(shù)值是實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次的均數(shù)結(jié)果；與A組相比，*P<0.05

二、圓形精子細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合中的胚胎發(fā)育形態(tài)

圓形精子細(xì)胞(圖2A)與激活的無(wú)透明帶卵母細(xì)胞(圖2C)融合后，卵子恢復(fù)減數(shù)分裂，釋放第二極體，隨后圓形精子細(xì)胞染色質(zhì)去濃縮，形成雄原核，卵子的染色體轉(zhuǎn)變成為雌原核，一般授精后16～18 h評(píng)估原核，最晚不超過(guò)20 h，雌雄原核相互靠近(圖2D)，核膜破裂，雙方的遺傳物質(zhì)混合，啟動(dòng)有絲分裂。在受精24 h后進(jìn)行第一次卵裂，形成2-細(xì)胞，之后每間隔約12 h進(jìn)行一次卵裂，分別形成4-細(xì)胞、8-細(xì)胞(圖2E)。在卵裂至16細(xì)胞期時(shí)，發(fā)生致密化(compaction)，致密化發(fā)生后胚胎細(xì)胞開(kāi)始具有極性，內(nèi)部細(xì)胞和外部細(xì)胞之間發(fā)生了很大的變化，胚胎發(fā)育到桑椹胚時(shí)，大約具32個(gè)細(xì)胞。以后胚胎的外部細(xì)胞開(kāi)始分泌液體，逐漸出現(xiàn)胚泡腔，標(biāo)志著囊胚(圖2F)的形成(圖2)。

A：圓形精子細(xì)胞(箭頭所示)(40×)；B：激活的MII期卵母細(xì)胞(20×);C：激活的無(wú)透明帶卵母細(xì)胞(10×)；D：融合胚胎出現(xiàn)雌雄原核(20×)；E：融合胚胎發(fā)育至8-細(xì)胞(10×)；F：融合胚胎發(fā)育至囊胚(20×)圖2 小鼠圓形精子細(xì)胞與去透明帶卵母細(xì)胞融合胚胎的發(fā)育

討 論

在臨床實(shí)踐中，利用卵胞漿內(nèi)單精子注射 (ICSI) 技術(shù)將精子注射入發(fā)育成熟度欠佳的卵母細(xì)胞后，受精卵易發(fā)生退化，患者獲得可利用的胚胎很少，甚至有的患者無(wú)可利用胚胎。由于顯微操作儀器價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)要求非常高，因此患者需要繳納昂貴的手術(shù)費(fèi)用。而HMC技術(shù)與ICSI 技術(shù)相比，不僅操作簡(jiǎn)單，而且節(jié)約成本，因此可以作為男性原發(fā)性無(wú)精子癥、非梗阻性無(wú)精子癥或女性卵母細(xì)胞發(fā)育成熟度欠佳患者治療的一種參考方法。

在HMC過(guò)程中，卵母細(xì)胞的預(yù)激活不僅能夠增加卵細(xì)胞膜內(nèi)離子的交換，而且能提高細(xì)胞膜的融合[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)在圓形精子細(xì)胞與無(wú)透明帶卵母細(xì)胞電融合之前預(yù)先采120 V/mm、10 μs×1次電脈沖激活卵母細(xì)胞。在三組電融合參數(shù)作用下使圓形精子細(xì)胞-卵母細(xì)胞對(duì)融合。研究表明利用電融合技術(shù)聯(lián)合化學(xué)激活方法更有利于無(wú)透明帶卵母細(xì)胞重構(gòu)胚胎的發(fā)育[11-12]。因此本實(shí)驗(yàn)在圓形精子細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合后，將融合胚胎移入10 mmol/L SrCl2內(nèi)激活3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在A組電場(chǎng)強(qiáng)度為60 V/mm、脈沖寬度為30 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，圓形精子細(xì)胞-卵母細(xì)胞對(duì)的平均融合率及平均卵裂率均顯著高于B組、C組兩組電融合參數(shù)作用下圓形精子細(xì)胞與無(wú)透明帶卵母細(xì)胞的融合率、卵裂率；A組的囊胚形成率顯著高于C組的囊胚形成率。研究發(fā)現(xiàn)將圓形精子細(xì)胞注射入激活的卵母細(xì)胞后融合胚胎的卵裂率為54%～64%，而其中只有2%～7%的胚胎發(fā)育至囊胚[13-14]。李子義等[15]研究表明，將圓形精子細(xì)胞注入經(jīng)電激活處理的卵母細(xì)胞的透明帶下， 注射卵的融合率為34.6%，卵裂率為28.3%。通過(guò)比較可以得出，本實(shí)驗(yàn)融合胚胎的囊胚形成率比圓形精子細(xì)胞注射入激活的卵母細(xì)胞的融合胚胎的囊胚形成率高。其原因可能是小鼠卵母細(xì)胞透明帶薄而且脆性較大，卵胞漿內(nèi)注射圓形精子細(xì)胞后卵容易發(fā)生退化，而本研究采用HMC技術(shù)降低了對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，大大提高了融合胚胎的卵裂率及囊胚形成率。Suo等[16]研究表明，小鼠2-細(xì)胞胚胎在0.8 kv/cm電場(chǎng)作用下胚胎的融合率及囊胚形成率較高；周川等[17]研究表明在電場(chǎng)強(qiáng)度為80 V/mm、脈沖寬度為80 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，2-細(xì)胞胚胎的融合率(92.5%)及融合胚胎的卵裂率(97.3%)較高。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A組(60 V/mm、30 μs×2)電融合參數(shù)下，圓形精子細(xì)胞與卵母細(xì)胞的融合率、融合胚胎的卵裂率以及囊胚形成率較高，這可能是由于不同的細(xì)胞間融合所需要的融合參數(shù)不同。另外本實(shí)驗(yàn)采用WOW培養(yǎng)系統(tǒng)[10， 18]，可以為胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定的微環(huán)境，從而得到較高的囊胚形成率。

因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：采用WOW培養(yǎng)系統(tǒng)，在電場(chǎng)強(qiáng)度60 V/mm、脈沖寬度30 μs、脈沖次數(shù)為2的直流電融合參數(shù)下，更適合小鼠圓形精子細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合胚胎的發(fā)育，有助于提高胚胎的發(fā)育潛能。本研究也為男性原發(fā)性無(wú)精子癥、非梗阻性無(wú)精子癥患者獲得自身后代提供了參考方法。

[1] Kimura Y， Yanagimachi R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring[J]. Development， 1995， 121：2397-2405.

[2] Haigo K， Yamauchi Y， Yazama F， et al. Full-term development of hamster embryos produced by injection of round spermatids into oocytes[J]. Biol Reprod， 2004， 71：194-198.

[3] Tesarik J， Mendoza C， Testart J. Viable embryos from injection of round spermatids into oocytes[J]. N EnglJ Med， 1995， 333：525-525.

[4] Selokar N， George A， Saha A. Production of interspecies handmade cloned embryos by nuclear transfer of cattle， goat and rat fibroblasts to buffalo (Bubalus bubalis) oocytes[J]. Anim Reprod Sci， 2011， 123：279-282.

[5] Tecirlioglu RT， French AJ， Lewis IM， et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo[J]. Reprod Fertil Dev， 2003， 15：361-366.

[6] Lagutina I， Lazzari G， Duchi R， et al. Somatic cell nuclear transfer in horses： effect of oocyte morphology， embryo reconstruction method and donor cell type[J]. Reproduction， 2005， 130：559-567.

[7] Du Y， Kragh PM， Zhang Y， et al. Piglets born from handmade cloning， an innovative cloning method without micromanipulation[J].Theriegenol， 2007， 68：1104-1110.

[8] Zhu J， Telfer EE， Fletcher J， et al. Improvement of an electrical activation protocol for porcine oocytes[J]. Biol Reprod， 2002， 66：635-641.

[9] Ogura A， Yanagimachi R. Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes form pronuclei and participate in syngamy[J]. Biol Reprod， 1993， 48： 219-225.

[10] Booth PJ， Tan S， Reipurth R， et al. Simplification of bovine somatic cell nuclear transfer by application of a zona-free manipulation technique[J]. Cloning Stem Cells， 2001， 3：139-150.

[11] George A， Shah R， Sharma R， et al. Activation of zona-free Buffalo (Bubalus bubalis) oocytes by chemical or electrical stimulation， and subsequent parthenogenetic embryo development[J]. Reprod Domest Anim， 2011， 46：444-447.

[12] Hajian M， Kiani M， Hosseini MS， et al. Specific activation requirements of zona-free sheep oocytes before and after somatic cell nuclear transfer[J]. Cell Reprogram， 2013， 15：247-257.

[13] Ock SA， Kwack DO， Lee SL， et al. In vitro development of bovine oocytes reconstructed with round spermatids[J].Theriegenol， 2006， 65：1242-1253.

[14] Goto K， Kinoshita A， Nakanishi Y， et al. Blastocyst formation following intracytoplasmic injection of in-vitro derived spermatids into bovine oocytes[J]. Hum Reprod， 1996， 11：824-829.

[15] 李子義， 譚景和. 小鼠精子和球形精子細(xì)胞顯微注射受精研究[J]. 解剖學(xué)報(bào)， 1999， 30：147-151.

[16] Suo L， Wang F， Zhou GB， et al. Optimal concentration of calcium and electric field levels improve tetraploid embryo production by electrofusion in mice[J]. J Reprod Dev， 2009， 55：383-385.

[17] 周川，趙云程. 不同電融合參數(shù)及融合液對(duì)昆明小鼠2-細(xì)胞胚胎融合及囊胚率的影響[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2012， 33：56-59.

[18] Vajta G， Peura T， Holm P， et al. New method for culture of zona-included or zona-free embryos： The Well of the Well (WOW) system[J]. Mol Reprod Dev， 2000， 55：256-264.

[編輯：辛玲]

Effects of different electrocution parameters on development of embryos fused by round spermatids and oocytes

YANG Ai-jun1#，YU Chun-na2#，NIU Huan-fu2， WANG Xue-nan2， LIU Shu-zhen3， WEI Ze-feng2，HAO Cui-fang1*

1.QingdaoUniversity，Qingdao266071 2.CenterofReproductiveMedicine，TheAffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity，Jining272029 3.CollegeofLifeScience，ShandongNormalUniversity，Jinan250014

Objective： To explore the effects of different electrofusion parameters on the developmental potential of embryos which were fused by round spermatids and zona-free oocytes with handmade cloning (HMC).Methods： A total of 549 oocytes and round spermatids were fused by handmade cloning. The electric fusion parameters were divided into three groups according to the different electrofusion parameters. The electric field intensity was 60， 80 and 100V/mm in group A (n=186)， group B (n=188)and group C(n=175)respectively. The pulse width was 30， 20， 10 μs of pulse width in group A， B， C respectively， and all number of direct current (DC) was 2. The electric fusion rates， cleavage rate and blastocyst formation rate of embryos fused by round spermatids and zona-free oocytes of mouse under the different electrofusion parameters were measured and recorded.Results： The results showed that the fusion rate of group A [(84.87±3.84)%]was significantly higher than that of the other two groups [(74.93±5.46)%， (73.60±5.48)%， respectively] (P<0.05). The cleavage rate of group A [(77.37±3.97%] was significantly higher than that of group B or group C [(67.74±7.32)%， (66.17±9.87)%， respectively] (P<0.05). The blastocyst rate of group A [(41.28±6.50)%] was significantly higher than that of group C [(31.03±6.09) %] (P<0.05).Conclusions： The best electrofusion parameters are 60 v/mm and 30 μs×2. It is beneficial to improve the developmental potential of embryo.

Electrofusion parameter； Round spermatids； Zona-free oocytes

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.010

2016-07-01；

2016-09-13

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院苗圃計(jì)劃項(xiàng)目(JYFY-MP-2013-MS-013)；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院科研計(jì)劃項(xiàng)目(JY2013KJ016)；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院苗圃計(jì)劃項(xiàng)目(MP-2014-003)；濟(jì)寧市科技局(2013jnwk132)

楊愛(ài)軍，女，山東濟(jì)寧人，博士研究生，主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)；于春娜，女，山東煙臺(tái)人，碩士，初級(jí)技師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(#并列第一作者；*