舒敬奎 戴路明 方利洲 張劍青 馮家鋼

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β2-AR基因多態(tài)性對(duì)哮喘患者沙美特羅替卡松吸入治療療效的影響

舒敬奎 戴路明 方利洲 張劍青 馮家鋼

目的 探討β2-腎上腺素能受體(β2-AR)基因多態(tài)性對(duì)本地區(qū)哮喘患者沙美特羅替卡松吸入治療的療效的影響。方法 2013年12月至2015年9月選取本院呼吸內(nèi)科收治的84例哮喘急性期患者為哮喘組，患者均行沙美特羅替卡松吸入治療，另選取80例健康體檢者為對(duì)照組，采用TaqMan-PCR法測(cè)定兩組β2-AR的16位點(diǎn)(A-G)基因多態(tài)性，分析β2-AR基因多態(tài)性對(duì)哮喘患者沙美特羅替卡松吸入治療的療效影響及肺功能的影響。結(jié)果 與對(duì)照組相比，哮喘組β2-AR16位點(diǎn)中GG型基因及G等位基因頻率比例較高(P<0.05)。84例哮喘患者中療效差組GG型基因及G等位基因頻率高于療效理想組(P<0.05)。哮喘組患者β2-AR中GG基因型患者治療后肺活量(VC)、肺總量(TLC)、用力呼氣肺活量(FVC)、用力呼氣肺活量1秒量(FEV1)、用力呼氣肺活量1秒率(FEV1/FVC)及一氧化碳彌散量(DLCO)水平低于AA型及AG型，而AA及AG基因型治療后肺功能指標(biāo)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 哮喘患者中β2-AR的16位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與本地區(qū)哮喘的發(fā)生有密切的關(guān)系，攜帶β2-AR變異等位基因G型可能會(huì)影響沙美特羅替卡松吸入治療的效果。

β2-腎上腺素能受體；基因多態(tài)性；哮喘；沙美特羅替卡松；治療效果

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是呼吸內(nèi)科常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，患者表現(xiàn)為易復(fù)發(fā)、病程長(zhǎng)，給患者身心健康帶來(lái)較大的影響[1]?；颊吲R床特點(diǎn)為氣道炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂及氣道高反應(yīng)性。吸入β2-腎上腺素能受體(β2- adrenergic receptor,β2-AR)激動(dòng)劑(沙美特羅替卡松)是目前治療哮喘常用的治療方法之一，但不少研究發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體間藥物療效存在較大的差異[2]。隨著對(duì)哮喘藥物基因研究的深入，近年發(fā)現(xiàn)β2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑在哮喘治療中的效果受其基因多態(tài)性影響，β2-AR基因多態(tài)性可能與哮喘發(fā)生、病情進(jìn)展及預(yù)后有密切的關(guān)系[3]。人類β2-AR基因位于染色體5q31-32基因片段上，β2-AR基因多態(tài)性為編碼區(qū)中第16個(gè)位點(diǎn)的精氨酸(Arg)向甘氨酸(Gly)突變[4]，因此本研究將探討β2-AR基因多態(tài)性在本地區(qū)哮喘患者發(fā)病中的作用機(jī)制及其對(duì)哮喘患者應(yīng)用β2-AR激動(dòng)劑治療療效的影響，旨在尋找β2-腎上腺素能受體基因位點(diǎn)遺傳效應(yīng)及藥物遺傳學(xué)標(biāo)記，為本地區(qū)哮喘臨床用藥提供指導(dǎo)。

資料與方法

一、臨床資料

2013年12月-2015年9月選取本院呼吸內(nèi)科收治的84例哮喘急性期患者為哮喘組，納入標(biāo)準(zhǔn)：① 均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)制定“哮喘防治指南”中對(duì)哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；② 經(jīng)支氣管激發(fā)試驗(yàn)檢查可發(fā)現(xiàn)患者存在明顯的氣道高反應(yīng)性；③ 均簽署知情同意書(shū)，且所有病例獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 其他呼吸系統(tǒng)性疾病；② 心、肝、腎功能不全者；③ 入組前4周呼吸道感染病史、應(yīng)用過(guò)全身糖皮質(zhì)激素、抗白三烯、抗組胺及緩釋茶堿等藥物者。男44例，女40例，年齡18-65歲，平均(35.6±2.7)歲，體質(zhì)量(BMI)23.8-28.5 kg/m2,平均(25.2±2.2)kg/m2；病程2-5年，平均(3.2±0.8)年。另選取80例健康體檢者為對(duì)照組，患者均無(wú)呼吸道疾病或應(yīng)變性疾病，男 42例，女 38例，年齡 18-72 歲，平均(36.2±2.8)歲，體質(zhì)量(BMI)23.7-28.8 kg/m2,平均(25.5±2.4)kg/m2，兩組性別、年齡、體質(zhì)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

二、方法

1 治療方法：84例哮喘患者采用沙美特羅替卡松干粉劑(廠家：葛蘭素史克；規(guī)格：60泡/盒×50ug；批號(hào)：201509123)吸入治療，每天2次，持續(xù)治療12周，患者每4周復(fù)診1次，評(píng)估治療效果。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)制定“哮喘防治指南”相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將治療后哮喘患者分為完全控制、部分控制及未控制，將完全控制及部分控制患者設(shè)為療效理想組(n=58)，將未控制患者設(shè)為療效差組(n=26)。

2 基因多態(tài)性測(cè)定：① 兩組患者均抽取靜脈血3 mL，應(yīng)用鹽析法提取DNA，待DNA溶解于TE溶液后，測(cè)定其在280 nm下的分光光度植，并計(jì)算每個(gè)樣本濃度及純度，根據(jù)所需要的濃度將DNA原液稀釋至合適濃度工作液；② 設(shè)計(jì)DNA引物：上游引物序列 5’-GCTCCGGTAGGTCACG-3’；下游引物序列 5’-CCTGGGTCAAGTGTCGGAG-3’；③ PCR反應(yīng)體系：分別在DNA樣本中加入2 μL 模板DNA，4 μL上游引物，4 μL下游引物，2 μL dNTs，5 μL 10×PCR buffer，32.5 μL，0.5 μL Taq Polymerase；④ PCR擴(kuò)增條件：樣液在94 ℃中預(yù)變性5 min，然后變性45 s，退火61 °C 45s，延伸72 ℃ 45 s，末端延伸72 ℃ 5 min，并在退火階段收集熒光信號(hào)。⑤ 采用熒光定量PCR儀測(cè)定TapMan探針上的FAM熒光信號(hào)。等位基因頻率=(2×純合子+雜合子)/(2×受體人數(shù))。按照Hardy-Weinberg平衡法對(duì)群體代表樣本進(jìn)行分析。

3 肺功能測(cè)定：哮喘組患者分別于治療前后應(yīng)用德國(guó)JAEGER公司提供的MAS TERSCREEN肺功能檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定肺功能，檢測(cè)項(xiàng)目包括肺活量(VC)、肺總量(TLC)、用力呼氣肺活量(FVC)、用力呼氣肺活量1秒量(FEV1)、用力呼氣肺活量1秒率(FEV1/FVC)及一氧化碳彌散量(DLCO)。除FEV1/FVC外，各項(xiàng)指標(biāo)采用實(shí)測(cè)值占預(yù)計(jì)值百分比表示。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、哮喘組與對(duì)照組β2-AR基因型及頻次對(duì)比

哮喘組患者AA、AG、GG型基因型分別為21.43%、38.09%、40.47%，等位基因A、G頻率分別為0.185、0.875，對(duì)照組AA、AG、GG型基因型分別為62.50%、35.00%、2.50%，等位基因A、G頻率分別為0.725、0.275，(見(jiàn)表1)。

表1 哮喘組與對(duì)照組β2-AR基因型及頻次對(duì)比

二、哮喘患者中療效差組與療效理想組β2-AR基因型及頻次對(duì)比

84例哮喘患者中，療效理想組AA、AG、GG型基因型分別為27.59%、48.28%、24.13%，等位基因A、G頻率分別為0.588、0.412，療效差組AA、AG、GG型基因型分別為7.69%、15.39%、76.92%，等位基因A、G頻率分別為0.789、0.211。(見(jiàn)表2)。

三、哮喘組患者不同基因型治療前后肺功能指標(biāo)比較

各基因型治療前VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平比較差異不顯著(P>0.05)，AA型及AG型治療后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平較治療前均得到顯著改善(P<0.05)，而GG基因型患者治療前后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，哮喘組患者β2-AR中GG基因型患者治療后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平低于AA型及AG型，而AA及AG基因型治療后肺功能指標(biāo)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05，(見(jiàn)表3)。

表2 哮喘患者中療效差組與療效理想組β2-AR基因型及頻次對(duì)比

表3 哮喘組患者不同基因型治療前后肺功能指標(biāo)比較±s)

注：與AA型相比，aP<0.05；與AG型相比，bP<0.05

討 論

目前關(guān)于β2-AR基因16位點(diǎn)基因多態(tài)性在不同人群中對(duì)哮喘的影響報(bào)道不盡相同。Bandaru等[6]對(duì)北美哮喘患者進(jìn)行病例對(duì)照組研究發(fā)現(xiàn)，β2-AR基因16位點(diǎn)A向G突變與哮喘的發(fā)生有密切的關(guān)系，而Rumzhum等[7]對(duì)歐洲哮喘人群進(jìn)行研究時(shí)未發(fā)現(xiàn)β2-AR基因16位點(diǎn)上基因多態(tài)性。Werner等[8]在美國(guó)黑人哮喘人群中進(jìn)行病理對(duì)照研究未發(fā)現(xiàn)β2-AR基因多態(tài)性與哮喘發(fā)病有關(guān)，但β2-AR基因多態(tài)性可增強(qiáng)患者血清特異性IgE水平。中國(guó)Leite等[9]研究發(fā)現(xiàn)，β2-AR基因GG基因型與哮喘發(fā)病有關(guān)，但與哮喘病情進(jìn)展無(wú)關(guān)。本研究入組人群均為本地區(qū)哮喘患者，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明入選人群代表性好。本研究中哮喘患者GG基因型及G基因頻率高于對(duì)照組，從而提示GG基因型可能是哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)基因型，而G等位基因可能是本地區(qū)哮喘患者遺傳易感基因。導(dǎo)致不同地區(qū)哮喘患者基因型差異的原因可能與不同種族人群間遺傳背景、樣本量、研究方法、患者年齡及哮喘類型存在差異有關(guān)。

沙美特羅是目前治療哮喘最常用的藥物之一，與丙酸氟替卡松聯(lián)合應(yīng)用療效優(yōu)于單純吸入高劑量糖皮質(zhì)激素[10]。但臨床研究發(fā)現(xiàn)[11]，部分患者應(yīng)用沙美特羅替卡松吸入治療后效果不理想，患者仍出現(xiàn)急性發(fā)作，患者對(duì)藥物治療存在不同的應(yīng)答不能單純認(rèn)為是疾病嚴(yán)重程度不同或藥物依從性差異引起的。馮力等[12]研究認(rèn)為，導(dǎo)致沙美特羅替卡松治療哮喘療效差異的原因與患者β2-AR基因多態(tài)性有關(guān)。Shah等[13]通過(guò)一項(xiàng)隨機(jī)、分層對(duì)照的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者應(yīng)用短效β2受體激動(dòng)劑治療時(shí)其臨床療效受β2-AR基因多態(tài)性影響，因此建議對(duì)于A/G基因型哮喘患者應(yīng)避免應(yīng)用β2受體激動(dòng)劑治療。本研究結(jié)果顯示，療效差組AA、AG、GG型基因型分別為7.69%、15.39%、76.92%，療效理想組AA、AG、GG型基因型分別為27.59%、48.28%、24.13%，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明β2-AR基因多態(tài)性可影響沙美特羅替卡松治療哮喘的臨床效果。

肺功能是用于評(píng)價(jià)哮喘發(fā)病及預(yù)后的重要客觀指標(biāo)，哮喘患者臨床主要表現(xiàn)為氣道功能下降及氣流進(jìn)出氣道功能受限，因此通過(guò)測(cè)定肺功能將有助于反映哮喘患者病情進(jìn)展及預(yù)后情況[14]。本研究結(jié)果顯示，AA型及AG型治療后后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平較治療前均得到顯著改善(P<0.05)，而GG基因型患者治療前后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，哮喘組患者β2-AR中GG基因型患者治療后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平低于AA型及AG型，表明β2-AR基因多態(tài)性可影響哮喘患者肺功能，與AA型、AC型相比，GG基因型患者預(yù)后較差。陳慧芬等[15]研究認(rèn)為β2-AR基因多態(tài)性不會(huì)影響哮喘患者治療效果，本研究結(jié)果與之不盡相同，考慮可能與樣本種族性差異、地域差異及樣本量差異等因素有關(guān)。

綜上所述，哮喘患者中β2-AR的16位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與本地區(qū)哮喘的發(fā)生有密切的關(guān)系，攜帶β2-AR變異等位基因G型可能會(huì)影響沙美特羅替卡松吸入治療的效果。

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Impact of β2-AR gene polymorphism on treatment efficacy of salmeterol fluticasone propionate inhalation for patients with asthma

SHUJing-kui,DAILu-ming,FANGLi-zhou,ZHANGJian-qing,FENGJia-gang

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650031,China

Objective To investigate the impact of β2-ARgene polymorphism on treatment efficacy of salmeterol fluticasone propionate inhalation for patients with asthma. Methods 84 patients with acute asthma were selected as the asthma group and 80 cases of healthy subjects were selected as the control group from December 2013 to September 2015. The β2-AR16 loci (AG) of the two groups were assayed with TaqMan-PCR. The asthma salmeterol fluticasone propionate inhalation therapy efficacy and lung function were analyzed. Results The frequency of GG genotype and G allele in β2-AR16 sites was higher in the asthma group than in the control groups (P<0.05), and it was higher in the poor efficacy group than in the good efficacy group (P<0.05). The levels of vital capacity (VC), total lung capacity (TLC), forced expiratory vital capacity (FVC), forced expiratory vital capacity 1 second volume (FEV1), forced expiratory vital capacity 1 seconds ratio (FEV1/FVC) and carbon monoxide diffusing capacity (DLCO) of GG genotype patients were higher than AA and AG genotypes, but there was no significant difference in pulmonary function after treatment between AA and AG genotypes (P>0.05). Conclusion The gene polymorphism of β2-AR16-site may be associated with the incidence of asthma, and G type patients carrying β2-ARvariant allele may have poor salmeterol fluticasone propionate inhalation therapy effect.

β2-adrenergic receptor; gene polymorphism; asthma; salmeterol and fluticasone propionate; treatment effect

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.032

650031 云南 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

2016-06-03]